"МУК 4.1.2276-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств цимоксанила в виноградном соке методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.09.2007)

1. Разработаны: Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-гигиеническому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 21.06.2007).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко.

4. Вводятся в действие с 10 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в виноградном соке массовой концентрации Цимоксанила в диапазоне 0,1 - 1,0 мг/кг.

Название по ИСО: Цимоксанил.

Название по ИЮПАК: 1-(2-циано-2-метоксииминоацетил)-3-этилмочевина.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 198,2.

Агрегатное состояние: кристаллическое вещество.

Цвет, запах: бесцветное вещество, без запаха.

Температура плавления: 160 - 161 °C.

Летучесть (давление паров): 0,15 мПа (при 20 °C).

Растворимость в воде при 20 °C (pH 5): 890 мг/куб. дм; в органических растворителях при 20 °C: гексане - 0,037; толуоле - 5,29; ацетонитриле - 57; этилацетате - 28; н-октаноле - 1,43; метаноле - 22,9; ацетоне - 62,4; хлороформе - 103; дихлорметане - 133,0 г/куб. дм.

Коэффициент распределения в системе октанол/вода при 25 °C: Kow log P = 0,59 (pH 5), 0,67 (pH 7).

В почве Цимоксанил быстро разрушается под действием микроорганизмов. В тепличных условиях период полураспада составляет около трех дней, в полевых условиях от - 7 до 14 дней. Миграция по почвенному профилю слабая.

В растениях соединение быстро разрушается до нетоксичных метаболитов. Остатки Цимоксанила в клубнях картофеля не обнаруживаются. В ягодах винограда, по данным фирмы Дюпон, остатки составляли ниже 0,2 мг/кг при обработке за несколько дней до уборки.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,02 мг/кг массы человека.

МДУ в картофеле и огурцах - 0,05; ВМДУ в винограде - 0,1 мг/кг.

Цимоксанил - контактный фунгицид с местным системным эффектом, обладающий защитным и лечащим действием. Высокоактивен против грибов, вызывающих фитофтороз и пероноспороз, не действует на возбудителей настоящей мучнистой росы. Длительность защитного действия составляет 4 - 6 дней, поэтому рекомендуется его использование в смеси с другими фунгицидами системного и защитного контактного действия.

Применяется в России в качестве фунгицида в составе смесевых препаратов на картофеле, томатах, виноградниках и подсолнечнике с нормой расхода 0,15 кг д.в./га, трехкратная обработка за сезон.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Метод основан на определении Цимоксанила методом ГЖХ с использованием капиллярной колонки и термоионного детектора после его экстракции из виноградного сока подкисленным ацетонитрилом, переэкстракции в хлористый метилен, очистки полученного экстракта от мешающих анализу веществ на колонке с Флоризилом и концентрирующих патронах Диапак С16.

Идентификация проводится по времени удерживания. Количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен и может применяться для определения остатков Цимоксанила в присутствии Фамоксадона. Избирательность метода достигается за счет подбора колонки и условий программирования.

Весы аналитические СИГМА 11140, фирма "OHAUS".

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г V600, "ACCULAB".

Колбы мерные вместимостью 10, 50 и 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц Гамильтон вместимостью 10 куб. мм.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100 и 250 куб. см, ГОСТ 1770.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аналитический стандарт Цимоксанила с содержанием 99,7% д.в. (фирма Дюпон).

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-06-1092-83.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Гелий очищенный марки "А", ТУ-51-940-80.

Концентрирующие патроны Диапак С16 (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94, БиоХимМак.

Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Этилацетат, х.ч., ГОСТ 22300-76.

Флоризил для колоночной хроматографии с размером частиц 60 - 80 меш, фирма "Агрос Органикс", Бельгия, код 205450010.

Хлористый метилен, х.ч., ГОСТ 19433-88.

Стандартный раствор Цимоксанила в ацетоне - 1 мг/куб. см (хранить в холодильнике, срок годности 120 суток).

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Аппарат для встряхивания проб TYP LT1 фирмы "SKLO UNION".

Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. N 3120-0250, NALGENE.

Воронки химические для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.

Цилиндры мерные HP.

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней B-480.

Концентраторы грушевидные на 100 и 250 куб. см, НШ 29 КГУ - 100 (250), ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5, длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирма J&W Scientific.

Насос вакуумный диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Фильтры бумажные "красная лента", ТУ 6-09-2678-77.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К подготовке проб допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия: процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

На дно пластиковой хроматографической колонки (высота 10 см, диаметр 1,5 см) помещают пробочку из стекловаты и заполняют колонку Флоризилом на высоту 5 см. На слой Флоризила насыпают слой безводного сернокислого натрия толщиной 1,0 куб. см. За день до очистки экстракта колонку промывают последовательно 20 куб. см этилацетата (остаток растворителя в колонке отжимают) и 10 см гексана, смывы отбрасывают и оставляют колонку на сутки до полного высыхания.

При отработке методики или поступлении новой партии Флоризила проводят изучение поведения Цимоксанила на колонке. В концентратор емкостью 100 куб. см помещают 1 куб. см стандартного раствора Цимоксанила в ацетоне с концентрацией 10 мкг/куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе. Далее растворяют стандарт в 1 куб. см этилацетата, добавляют 4 куб. см гексана, перемешивают содержимое и наносят на колонку. Пропускают через колонку 10 куб. см смеси гексан:этилацетат - 4:1, смыв отбрасывают. Наносят на колонку 10 куб. см смеси гексан:этилацетат - 1:1, смыв отбрасывают. Пропускают через колонку 20 куб. см смеси гексан:этилацетат - 1:4, отбирая последовательно по 5 куб. см элюента. Каждую фракцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторах растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм. По результатам обнаружения Цимоксанила в каждой фракции определяют объем смеси гексан:ацетон - 1:4, необходимый для полного вымывания Цимоксанила.

Патрон устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см, который используют как емкость для элюента. Патрон промывают последовательно 10 куб. см ацетонитрила и 10 куб. см дистиллированной воды. Промывку проводят под вакуумом непосредственно перед очисткой экстрактов образцов со скоростью не более 2 куб. см/мин., не допуская высыхания поверхности патрона.

В концентратор помещают 1 куб. см стандартного раствора Цимоксанила в ацетоне с концентрацией 10 мкг/куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе. Далее растворяют стандарт в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют в концентратор 10 куб. см дистиллированной воды, перемешивают содержимое и наносят на патрон. Смыв отбрасывают. Пропускают через патрон 20 куб. см смеси ацетонитрил:вода - 1:4, отбирая последовательно по 5 куб. см элюента. Каждую фракцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм пробы. По результатам обнаружения Цимоксанила в каждой фракции определяют объем смеси ацетонитрил:вода - 1:4, необходимый для полного вымывания Цимоксанила.

В емкость, содержащую 1 куб. дм ацетонитрила, добавляют 10 куб. см 1 н раствора хлороводородной кислоты и перемешивают содержимое.

Навеску 2 г безводного сульфата натрия вносят в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм, добавляют 600 - 700 куб. см дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения соли и доводят водой до метки.

Навеску 50 мг Цимоксанила (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/куб. см). Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.

Методом последовательного разбавления исходного раствора N 1 ацетоном готовят рабочие растворы Цимоксанила с концентрацией 1,0; 2,5; 5,0; 10,0 мкг/куб. см для построения калибровочного графика и для внесения в образцы, которые могут храниться в холодильнике не более 30 суток.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Цимоксанила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 2,5; 5,0; 10,0 мкг/куб. см.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Цимоксанила в растворе в мкг/куб. см (рисунок 1 - не приводится).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", N 2051-79 от 21.08.79, а также с ГОСТ 25892-83 - "Виноградный сок, ТУ".

Пробы соков хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре +4 °C не более 10 суток.

Пробу сока 20 г помещают в делительную воронку емкостью 250 куб. см, добавляют 20 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают содержимое воронки, приливают 50 куб. см подкисленного ацетонитрила и встряхивают содержимое воронки в течение двух минут. После разделения фаз нижний слой сливают в стакан емкостью 100 куб. см, а ацетонитрил - в концентратор емкостью 250 куб. см. Водно-солевую фазу из стакана возвращают в делительную воронку и повторяют переэкстракцию Цимоксанила в ацетонитрил еще 2 раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила и встряхивая смесь в течение двух минут. К объединенному экстракту приливают 20 куб. см дистиллированной воды и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка при температуре 40 °C.

Остаток в концентраторе разбавляют 50 куб. см 2% раствора безводного сульфата натрия, перемешивают содержимое концентратора и переносят в делительную воронку емкостью 250 куб. см. Обмывают концентратор еще раз 50 куб. см 2% раствора безводного сульфата натрия и сливают в ту же делительную воронку. Приливают в делительную воронку 40 куб. см хлористого метилена и встряхивают содержимое воронки в течение 1 - 2 минут. После расслоения фаз нижний слой хлористого метилена сливают через воронку с безводным сульфатом натрия в концентратор емкостью 250 куб. см. Повторяют экстракцию еще два раза, используя каждый раз по 30 куб. см хлористого метилена. Хлористый метилен выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C.

Далее проводят очистку пробы на колонке с Флоризилом.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 куб. см этилацетата, добавляют 4 куб. см гексана, тщательно обмывают концентратор и наносят содержимое на колонку с Флоризилом, подготовленную как указано в разделе 7.1.1. Промывают колонку 10 куб. см смеси гексан:этилацетат - 4:1, смыв отбрасывают. Пропускают через колонку 20 куб. см смеси гексан:этилацетат - 1:4, собирая элюат в концентратор емкостью 100 куб. см. Содержимое концентратора выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, добавляют 10 куб. см дистиллированной воды, перемешивают содержимое, обмывая стенки концентратора, и наносят на патрон.

Пропускают 15 куб. см смеси ацетонитрил:вода - 1:4, смыв собирают в концентратор и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм пробы.

Капиллярная кварцевая колонка НР-5 (5% дифенил и 95% диметилполисилоксан), длина 10 м, внутренний диаметр 0,53 мм, толщина пленки 2,7 мкм.

Температура термостата колонки программированная: начальная температура - 100 °C, выдержка 1 минута, нагрев колонки по 20 °C в минуту до 170 °C, по 25 °C в минуту до - 200 °C; время анализа - 11 мин.

Температура испарителя - 200 °C, детектора - 300 °C.

Газ 1 - гелий (газ-носитель), давление на входе - 6 кПа, линейная скорость - 22,984 см/сек., давление на выходе - 101,3 кПа; поток через колонку - 2,504 куб. см/мин.; мертвое время - 0,73 мин.

Газ 2 - гелий, режим - Split less, деление потока - 1:30 (сброс пробы), начало сброса - 30 секунд, длительность сброса - 2 минуты, расход во время анализа - 10 куб. см/мин.

Регулятор давления гелия - РРГ-10.

Регулятор расхода гелия - РРГ-11.

Газ 4 - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 30 куб. см/мин.

Газ 5 - водород, расход во время анализа - 11,5 куб. см/мин.

Газ 6 - воздух, расход - 200 куб. см/мин.

Продувка детектора и испарителя азотом после анализа - по 50 куб. см/мин. в течение 3 минут при температуре колонки 250 °C. Расход газов: Г1 - 50; Г2 - 40; Г4 - 40 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания Цимоксанила - 6 мин. 2 сек. - 6 мин. 45 сек.

Объем вводимой пробы - 1 куб. мм.

Минимально детектируемое количество Цимоксанила в анализируемом объеме - 1,0 нг.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 1,0 - 10,0 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор с концентрацией Цимоксанила 10,0 мкг/куб. см, соответственно разбавляют.

Для определения содержания Цимоксанила в пробах методом ГЖХ используют следующую формулу:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".