"МУК 4.1.2453-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флорасулама в кукурузном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.02.2009)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 г.

4. Введены в действие с 29 апреля 2009 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флорасулама в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг в кукурузном масле.

Флорасулам. Название действующего вещества по ИЮПАК:

К-(2,6-дифторфенил)-8-фтор-5метокси-1,2,4-триазоло[1,5-с]пиримидин-2-сульфонамид.

Структурная формула (не приводится).

Область применения: флорасулам - гербицид системного действия, проникает в растения через корни и листья, но не проникает в зерно, ингибирует ацетолактатсинтазу - ключевой фермент в пути синтеза изолейцина и валина.

Флорасулам вызывает хлороз, обесцвечивание жилок и некроз в течение 2 - 4 недель.

В России применяется в качестве гербицида в посевах кукурузы и зерновых культур с нормой расхода 2,5 - 5,0 г/га по д.в. в смеси с другими гербицидами при однократной обработке в фазу кущения или 3 - 4 листьев кукурузы.

В России гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении флорасулама с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистке перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, последующего метилирования и очистки метальных производных на концентрирующих патронах, содержащих обращенную фазу С8.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак С8 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на патронах, построение калибровочной кривой.

7.1.1. Очистка ацетона. Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия (А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика. Москва, 1976, с. 438 - 439).

7.1.2. Очистка ацетонитрила. Ацетонитрил перегоняют.

7.1.3. Очистка гексана. Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика. Москва, 1976, с. 441).

7.1.4. Очистка бидистиллированной воды. Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцовокислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.

7.1.5. Очистка диэтилового эфира. Диэтиловый эфир перегоняют.

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ. Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1 куб. дм помещают 450 куб. см ацетонитрила и 500 куб. см очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов.

7.2.2.1. Стандартный раствор с концентрацией флорасулама 1,0 мг/куб. см. Взвешивают 50 мг флорасулама в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.2.2.2. Стандартный раствор с концентрацией флорасулама 10,0 мкг/куб. см. Из стандартного раствора флорасулама с концентрацией 1,0 мг/куб. см отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании.

7.2.2.3. Стандартные растворы флорасулама с концентрацией 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/куб. см для внесения в образцы масла. Методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие по 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/куб. см, и используют эти растворы для внесения в образцы масла.

Для хроматографического исследования стандарт подвергают процедурам очистки на концентрирующих патронах и метилированию, чтобы нивелировать потери, возникающие при этих манипуляциях при очистке фортифицированных проб. Эти операции проводят каждый раз при анализе очередной партии образцов.

7.2.2.4. Метилирование стандартов. В круглодонную колбу объемом 100 куб. см помещают 1 куб. см стандартного раствора флорасулама в ацетонитриле с концентрацией 10,0 мкг/куб. см. Туда же добавляют последовательно 100 мкл триэтиламина и 100 мкл йодистого метила, помещают смесь в ультразвуковую ванну на 5 с и выдерживают при температуре 22 - 25 °С в течение часа. По истечении этого времени смесь упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе (на стенках колбы образуются белые кристаллы).

К сухому остатку добавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, тщательно обмывают стенки концентратора и переносят раствор в делительную воронку. Концентратор обмывают 10 куб. см диэтилового эфира, переносят его в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний слой (диэтиловый эфир) собирают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия. Экстракцию диэтиловым эфиром повторяют еще 2 раза, используя по 10 куб. см растворителя. Экстракт объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток подвергают очистке на патроне Диапак С8, элюат выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила (получают метилированный стандарт с концентрацией 1,0 мкг/куб. см). Далее методом последовательного разведения ацетонитрилом получают стандартные растворы с концентрацией 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации метилированного производного флорасулама в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

7.4.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С8 (0,6 г) для очистки экстракта. Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов не должна превышать 2 - 2,5 куб. см/мин.

Патрон Диапак С8 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: патрон промывают последовательно 5 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1 и 10 куб. см очищенной воды. Элюат отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности картриджа.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения метилированного стандарта флорасулама на концентрирующем патроне Диапак С8. Из раствора метилированного стандарта флорасулама в ацетонитриле, содержащего 2 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см и помещают в концентратор объемом 100 куб. см. Добавляют туда же 9 куб. см очищенной воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Патрон промывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:5, элюат собирают, упаривают досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Далее патрон промывают последовательно 4 порциями по 5 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1, элюат после внесения каждой порции упаривают досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие метилированный флорасулам, и объединяют их.

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry С18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 ч.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 8808-91 "Масло кукурузное, ТУ".

Пробы масла кукурузы хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С не более 30 дней.

9.1.1. Экстракция. Пробу масла весом 10 г помещают в химический стакан объемом 100 куб. см, прибавляют туда же 20 куб. см гексана, тщательно перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Химический стакан обмывают последовательно двумя порциями гексана объемом 20 и 10 куб. см и смывы переносят в ту же делительную воронку.

Затем в делительную воронку с гексановым раствором масла помещают 30 куб. см ацетонитрила и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой помещают в химический стакан объемом 200 куб. см, верхний гексановый слой оставляют в делительной воронке. Флорасулам экстрагируют еще тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 куб. см в тех же условиях. Ацетонитрильный экстракт объединяют в химическом стакане объемом 200 куб. см.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей. Ацетонитрильный экстракт, полученный по п. 9.1.1, переносят в чистую делительную воронку объемом 250 куб. см, туда же прибавляют 50 куб. см гексана и интенсивно встряхивают 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см в концентратор объемом 250 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Гексан отбрасывают.

9.1.3. Метилирование. Сухой экстракт, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила. Туда же добавляют последовательно 100 мкл триэтиламина и 100 мкл йодистого метила, помещают смесь в ультразвуковую ванну на 5 с и выдерживают при температуре 22 - 25 °С в течение часа. По истечении этого времени смесь упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе (на стенках колбы образуются белые кристаллы).

К сухому остатку добавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, тщательно обмывают стенки концентратора и переносят раствор в делительную воронку. Концентратор обмывают 10 куб. см диэтилового эфира, переносят его в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний слой (диэтиловый эфир) собирают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия. Экстракцию диэтиловым эфиром повторяют еще 2 раза, используя по 10 куб. см растворителя. Экстракт объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

--------------------------------

<*> Повторное упаривание и перерастворение образца неприемлемо, так как при этом уменьшается содержание метилированного производного флорасулама в пробе.

9.1.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С8.

Сухой остаток после метилирования растворяют в 1,0 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9,0 куб. см воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон Диапак С8. Патрон промывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:5. Элюат отбрасывают. Флорасулам элюируют с картриджа 15 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1, элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 куб. см ацетонитрила и аликвоту объемом 20 куб. мм вводят в хроматограф.

Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 4,6 мм х 25 см, зернением 5 мкм. Предколонка стальная Symmetry С18, 3,9 мм х 2 см, зернением 5 мкм. Температура колонки: 25 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 45:50. Длина волны 260 нм.

Время удерживания флорасулама - 12,1 - 12,5 мин. Чувствительность - 0,003 ед. оптической плотности на шкалу. Объем вводимой пробы - 20 куб. мм. Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа "Agilent Chemstation".

Альтернативная обработка результатов.

Содержание флорасулама рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,025 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,025 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):