"МУК 4.1.2109-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации 2-хлорфенола в биосредах (моча) газохроматографическим методом. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 09.08.2006)

Методические указания по определению концентраций химических веществ в биологических средах предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием органических соединений в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "ГСОЕИ. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации 2-хлорфенола в моче в диапазоне концентраций: от 0,05 до 1,80 мкг/куб. см с погрешностью 23,0% при доверительной вероятности 0,95.

2-Хлорфенол

2-Хлорфенол - бесцветная жидкость с резким неприятным запахом.

Температура кипения - 175 °С. Кумулятивные свойства выражены умеренно. Вызывает нарушения функции почек и печени, при периодическом попадании на кожу - новообразования [1].

Методика основана на предварительном концентрировании анализируемого соединения из биологического материала (моча) экстракцией бутилацетатом и последующем газохроматографическом анализе экстракта.

Выполнение измерений массовой концентрации 2-хлорфенола выполняют методом газовой хроматографии с использованием детектора электронного захвата.

Определению не мешают хлороформ, тетрахлорметан и другие хлорфенолы (температура кипения 3-хлорфенола - 214 °С) в количествах, не превышающих верхнюю границу измеряемой концентрации 2-хлорфенола.

Длительность анализа одной пробы мочи, включая экстракцию, - 40 мин.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками.

4.1. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76.

4.2. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях" (утверждены МЗ СССР 20.12.82) и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" (утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87).

4.3. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

4.4. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

6.1. При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 +/- 5) °С;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С.

6.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, подготовка хроматографической колонки, приготовление аттестованных смесей, установление градуировочной характеристики.

Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе дихромата калия в серной кислоте (3 г дихромата калия на 100 куб. см концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть бидистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой, устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (азота) с расходом 30 куб. см/мин. при температуре 250 °С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

7.3.1. Раствор соляной кислоты (1:3). В мерный стакан объемом 100 куб. см, содержащий 75 куб. см бидистиллированной воды, вводят 25 куб. см соляной кислоты (ро = 1,19). Раствор переносят в стеклянную склянку с притертой пробкой.

7.3.2. Раствор камфары 20%-й. Растворяют 2 г кристаллической камфары в 10 куб. см бутилацетата. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой не более 1 месяца.

7.3.3. Реагент для экстракции. К 100 куб. см бутилацетата прибавляют 0,4 куб. см 20%-го раствора камфары.

Для построения градуировочного графика собирают мочу, не содержащую определяемого компонента, и готовят серию аттестованных растворов.

Исходный аттестованный раствор. В мерную колбу объемом 100 куб. см, содержащую 50 куб. см мочи, вводят 2 куб. мм 2-хлорфенола и заполняют колбу до метки мочой. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет (с учетом плотности) 25,27 мкг/куб. см. Срок хранения - 12 ч.

Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной калибровки. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме (кв. мм) от массы 2-хлорфенола (мкг) и строится по 5 сериям рабочих аттестованных растворов. Каждую серию, состоящую их 5 рабочих аттестованных растворов, готовят в мерных колбах объемом 50 куб. см. В колбу объемом 50 куб. см, содержащую 30 куб. см мочи, добавляют исходную аттестованную смесь для градуировки в соответствии с табл. 1. Затем объем в колбе доводят мочой до метки.

Для построения градуировочной характеристики 2-хлорфенола аттестованный раствор в объеме 50 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют 30 г высаливателя (хлорид натрия), подкисляют раствором соляной кислоты (1:3) до pH = 2 и приливают 5 куб. м реагента для экстракции (раствор камфары в бутилацетате). Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин., после отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку и центрифугируют для денатурации белка 10 мин.

В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 2 куб. м каждого экстракта аттестованного раствора и анализируют в условиях:

температура термостата колонок - 110 °С;

температура испарителя - 170 °С;

температура детектора - 250 °С;

расход газа-носителя (азот) - 30 куб. см/мин.;

скорость диаграммной ленты - 240 мм/ч;

время удерживания 2-хлорфенола - 1 мин.

На полученной хроматограмме определяют площади пиков 2-хлорфенола и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику. Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии реактивов.

Отбор проб мочи в объеме не менее 200 куб. см производится в тщательно вымытый стеклянный сосуд с притертой пробкой. Анализ мочи проводить сразу или хранить в холодильнике не более 12 ч после отбора пробы.

Для определения 2-хлорфенола мочу в объеме 50 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют 30 г высаливателя (хлорид натрия), подкисляют раствором соляной кислоты (1:3) до pH = 2 и приливают 5 куб. см реагента для экстракции (раствор камфары в бутилацетате). Содержимое воронки интенсивно встряхивают 10 мин., после отстаивания эфирный экстракт сливают в пробирку и центрифугируют для денатурации белка 10 мин.

Полученный центрифугат хроматографируют и проводят количественное определение анализируемого соединения в подготовленной пробе по калибровочному графику. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб мочи. Условия выполнения измерений аналогичны условиям при установлении градуировочной характеристики (п. 7.5).

На хроматограмме рассчитывают площадь пика и по градуировочной характеристике определяют концентрацию 2-хлорфенола в моче.

Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2 и 3.

Контроль стабильности градуировочного графика проводят раз в квартал в анализируемой серии измерений, определяют содержание исследуемого соединения в градуировочных растворах, которые соответствуют началу, середине и концу градуировочного интервала. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%.

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Внутренний контроль воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие:

Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, устраняют их и процедуру контроля повторяют.

Периодичность ВКК регламентируется в Руководстве по качеству лаборатории.

1. Бандман А.Л., Войтенко Г.А., Волкова Н.В. и др. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводные углеводородов. Справ. изд./Под ред. В.А. Филова и др. Л.: "Химия", 1990.

Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С. Уланова, Т.В. Нурисламова, Н.А. Попова).