"МУК 4.1.1806-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств хлорсульфурона в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур, семенах и соломе льна методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 18.12.2003)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (проф. Т.В. Юдина), Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин) при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (гл. специалист А.П. Веселов), под редакцией член-корр. РАМН В.В. Ракитского.

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России (прот. N 20 от 2 декабря 2003 г.).

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 18 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

Торговое наименование: Фенизан, Корсаж, Тулиген, Метиген, Аминка ХС, Метис.

Фирма-регистрант: Щелково Агрохим, ОАО "Химпром", НИТИГ, КСМ-Корпорация, ООО "Волгохимпром".

Действующее вещество: хлорсульфурон.

Структурная формула (не приводится).

1-(2-хлорофенилсульфонил)-3-(6-метил-4-метокси-1,3,5-триазин-2-ил)мочевина (IUPAC).

2-хлоро-N-[[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)амино]карбонил]бензилсульфонамид (СА).

Мол. масса: 357,8.

Растворимость (г/л): в воде - 0,59 (рН 5), 31,8 (рН 7) при 25 °С; дихлорметане - 1,4, ацетоне - 4, метаноле - 15, толуоле - 3, гексане < 0,01 (20 °С).

Онкогенной, мутагенной и тератогенной активности в стандартных тестах не обнаружено. Селективный системный гербицид абсорбируется листьями и корнями. Используется для борьбы с самыми широко распространенными сорняками на полях зерновых колосовых культур.

Гигиенические нормативы для хлорсульфурона в России:

Содержание в почве не допускается, ПДК в воде водоемов - 0,01 мг/куб. дм. Содержание хлорсульфурона в семенах и соломе льна не допускается. Для зерновых колосовых культур гигиенические нормативы в России не установлены.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении хлорсульфурона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой, перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

Ацетон, о.с.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-3716-80.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калий фосфорнокислый 2-замещенный, 3-водный, ч.д.а., ГОСТ 2493-75; 0,1М водный раствор.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная, имп. (Ferak, Германия), или х.ч., ГОСТ 6552-80; 2М и 0,005М водные растворы.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Хлорсульфурон, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98% (Украина).

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - 0,005М ортофосфорная кислота (37:63, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 - 0,063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (30:70, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (15:85, по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Колонка Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters).

Предколонка Waters Symmetry С-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Бидистиллятор.

рН-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25 336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25 х 1) см.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно (семена) и солому измельчают на лабораторной мельнице.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для получения 90%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 900 мл ацетона со 100 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 37:63 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 мл смешивают 300 мл н-гексана и 700 мл этилацетата. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 мл смешивают 150 мл н-гексана и 850 мл этилацетата.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску хлорсульфурона (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/мл.) Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,25, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил:0,005М ортофосфорная кислота (34:66, по объему)).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты извлечения хлорсульфурона используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация хлорсульфурона в растворе) в хроматограф вводят по 20 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации хлорсульфурона в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 мл смеси гексан - этилацетат (30:70, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 мл элюента N 2 и 50 мл элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения хлорсульфурона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора хлорсульфурона с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента N 1, затем 120 мл элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание хлорсульфурона по п. 2.6.6.

Фракции, содержащие хлорсульфурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.6. Рассчитывают содержание хлорсульфурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: Параметры удерживания хлорсульфурона и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6.1. Определение хлорсульфурона в пробах воды

Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Извлечение хлорсульфурона из проб почвы

Образец воздушно-сухой почвы массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой, добавляют 100 мл 90%-го водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют с 50 мл 90%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (10 - 15 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С.

2.6.3. Извлечение хлорсульфурона из проб соломы и зерна зерновых колосовых культур, семян и соломы льна

2.6.4. Очистка экстрактов

Полученные по п.п. 2.6.2 и 2.6.3 водные экстракты промывают в делительной воронке объемом 250 мл трижды хлористым метиленом порциями по 30 мл (нижний органический слой отбрасывают) и дважды гексаном порциями по 50 мл (верхний органический слой отбрасывают), встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 1 - 2 минут. Водную фазу подкисляют 2М ортофосфорной кислотой до рН 3 и хлорсульфурон экстрагируют хлористым метиленом трижды по 30 мл, встряхивая воронку каждый раз в течение 2 - 3 мин. <*>. Верхний водный слой отбрасывают. Объединенную органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл хлористого метилена. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5 <**>.

--------------------------------

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку на стадии промывки экстрактов гексаном и хлористым метиленом - небольшое количество (до 10 мл) этилового спирта, а на стадии переэкстракции - насыщенный раствор хлорида натрия (15 - 20 мл).

<**> В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб (п. 2.6.3) дает удовлетворительные, результаты дополнительную очистку на колонке с силикагелем можно исключить.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.5. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при выпаривании очищенных по пп. 2.6.2 и 2.6.3 экстрактов почвы и растительного материала, количественно переносят двумя порциями по 5 мл смеси гексан - этилацетат (30:70, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 50 мл элюента N 1, затем 50 мл элюента N 2. Элюаты отбрасывают. Хлорсульфурон элюируют 70 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 мл. Раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.6. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы Waters с УФ-детектором (Waters 2487) или другой с аналогичными характеристиками.

Рабочая длина волны: 224 нм.

Предколонка Waters Symmetry С-18 для защиты аналитической колонки.

Колонка Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA). Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005М раствор ортофосфорной кислоты в соотношении 37:63. Скорость потока 1 мл/мин.

Время удерживания хлорсульфурона: 12,1 +/- 0,2 мин.

Объем вводимой пробы: 20 мкл.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 2,0 мкг/мл.

2.6.7. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание хлорсульфурона в образце воды, почвы или растений (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств хлорсульфурона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор хлорсульфурона 2 мкг/мл, разбавляют неподвижной фазой для ВЭЖХ.

При проведении работы необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе в химических лабораториях, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и других используемых приборов.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

Долженко В.И., Цибульская И.А., Юзихин О.С., Черменская Т.Д. (ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург).