"МУК 4.1.1851-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств клопиралида в семенах и масле рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 05.03.2004)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1.1. Краткая характеристика препарата

Фирма-изготовитель: Дау АгроСаенсес.

Торговое название: Лонтрел Гранд, Лонтрел-300.

Действующее вещество (д.в.): клопиралид.

Название д.в. по номенклатуре ИЮПАК: 3,6-=dichloropyridine-2-carboxylic acid.

Структурная формула д.в. (не приводится).

Молекулярная масса д.в.: 192,0.

Химически чистое вещество: кристаллы белого цвета.

Температура плавления д.в.: 151 - 152 °С.

Растворимость д.в. (г/кг) при 20 °С: в воде - 1,0, циклогексаноне - 387, ацетоне - 153, ксилоле - 6,5.

В обычных условиях устойчив, с органическими и неорганическими основаниями образует хорошо растворимые в воде соли.

1.2. Краткая токсикологическая характеристика д.в.

Гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов - 0,04 мг/л, ОДК в почве - 0,1 мг/кг, МДУ в зерне хлебных злаков - 0,2 мг/кг, ВМДУ в кукурузе и сахарной свекле - 0,1 мг/кг, капусте - 0,05 мг/кг.

1.3. Область применения препарата

Гербицид для борьбы с некоторыми однолетними и многолетними двудольными сорными растениями (в том числе сложноцветными и видами горца).

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении остаточных количеств клопиралида из анализируемого объекта органическими растворителями и проведении очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Количественное определение проводят методом внешнего стандарта с применением капиллярной газожидкостной хроматографии и использованием детектора электронного захвата (ДЭЗ).

2.1.2. Избирательность метода

Метод специфичен в присутствии других применяемых пестицидов. Проведение очистки экстрактов, а также использование капиллярной колонки и селективного детектора позволяет устранять влияние коэкстрактивных веществ на результаты анализа.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Диапазоны измеряемых концентраций, пределы обнаружения и другие метрологические параметры метода представлены в таблицах 1 и 2.

2.2. Реактивы, растворы, материалы

Аналитический стандарт клопиралида.

Азот газообразный высокой чистоты, ТУ 301-07-25-89.

Ацетон, осч, ТУ 2633-004-11291058-94.

Ацетонитрил для хроматографии, хч, ТУ 6-09-4326-76.

Вата медицинская, ТУ 9393-001-00302238-97.

н-Гексан, хч, ТУ 6-09-3375-78.

Дихлорметан, хч, ТУ 6-09-2662-77.

Изооктан эталонный, ГОСТ 12433-83.

Калия гидроокись, чда, ГОСТ 24363-80.

Натрий сернокислый б/в (сульфат), чда, ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, чда, ГОСТ 4233-77.

N-Нитрозометилмочевина, хч, ТУ 6-09-11-1643-82.

Серная кислота, осч, ГОСТ 14262-78.

Смесь н-гексан:этиловый эфир, 50:50, по объему.

Фильтры бумажные красная лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные белая лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные синяя лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Эфир этиловый (серный), ОСТ 84-2006-88.

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Газовый хроматограф с ДЭЗ.

Колонка хроматографическая кварцевая капиллярная длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой ВР-50 (типа OV-17), толщина пленки - 0,5 мкм.

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73, или аналогичный.

Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 34104-80.

Весы лабораторные типа ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-80.

Воронки делительные емкостью 250 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки для фильтрования стеклянные, ГОСТ 25336-82.

Индикаторная бумага универсальная, ТУ 6-09-1181-76.

Колбы-концентраторы емкостью 100 и 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы плоскодонные емкостью 100 и 300 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные со шлифом емкостью 25, 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Колпачки алюминиевые для герметизации флаконов, ГОСТ Р 51314-99.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79, или аналогичная.

Микрошприц МШ-10, ТУ 2-833-106.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Ротационный вакуумный испаритель типа ИР-1 или аналогичный.

Пипетки мерные емкостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74.

Приспособление для обжима колпачков на флаконах, ТУ 42-2-2442-73.

Пробирки мерные со шлифом емкостью 5,0 мл, ГОСТ 1770-74.

Стаканы химические на 100, 200 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Установка для перегонки растворителей при атмосферном давлении.

Установка для упаривания растворителей в токе азота.

Установка ультразвуковая "Серьга" УЗМ002 или аналогичная.

Флаконы стеклянные (типа пенициллиновых) емкостью 5,0 мл, ТУ 64-2-10-87.

Шкаф сушильный, ТУ 64-1-1411-76.

Электроплитка, ГОСТ 14919-83.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1. Подготовка и очистка растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.4.2. Приготовление стандартных растворов

Основной раствор клопиралида с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением в ацетоне 0,01 г аналитического стандарта в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре +4 - 6 °С не более трех месяцев.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 1,6, 0,8, 0,4 и 0,2 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора клопиралида последовательным разбавлением ацетоном. Рабочие растворы хранят в холодильнике при температуре +4 - 6 °С не более месяца.

В модельных опытах при изучении полноты извлечения клопиралида используют ацетоновые растворы стандартного вещества.

Для приготовления калибровочных растворов в мерные пробирки со шлифом емкостью 5,0 мл вносят по 1,0 мл рабочих растворов клопиралида с концентрациями 0,2, 0,4, 0,8 и 1,6 мкг/мл. Растворитель в пробирках упаривают в токе азота досуха и проводят метилирование клопиралида по п. 2.4.3.

2.4.3. Метилирование клопиралида

В пробирки с сухим остатком добавляют по 2,0 мл свежеприготовленного по п. 2.4.5 эфирного раствора диазометана. Пробирки закрывают пробками и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4 - 6 °С. После этого в пробирки добавляют по 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл.

2.4.4. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа (п. 2.7.3) вводят по 1 мкл приготовленных по п. 2.4.3 растворов, содержащих клопиралид (в виде производного) в концентрациях 0,2, 0,4, 0,8 и 1,6 мкг/мл. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм (кв. мм) от концентрации клопиралида в рабочем растворе в мкг/мл.

2.4.5. Приготовление эфирного раствора диазометана (из расчета метилирования экстрактов 2-х проб).

N-Нитрозометилмочевину массой 0,5 г помещают во флакон емкостью 2,0 - 3,0 мл и герметизируют резиновой пробкой и колпачком с помощью приспособления для обжима колпачков на флаконах. Этиловый эфир объемом 4,0 мл вносят в другой флакон емкостью 5,0 мл, герметизируют резиновой пробкой и колпачком и охлаждают в морозильной камере холодильника в течение 30 минут.

После этого флаконы через предварительно проколотые пробки соединяют гибкой тефлоновой трубкой (внутр. диам. ~ 1,5 - 2,0 мм), одним концом погружая ее в этиловый эфир на всю глубину (флакон с охлажденным этиловым эфиром обязательно должен еще иметь свободный выход в атмосферу). Во флакон с нитрозометилмочевиной, используя шприц с тонкой иглой и прокалывая пробку, добавляют по каплям по стенке 50%-ный водный раствор гидроокиси калия (~ 0,3 мл) до прекращения реакции. Этиловый эфир при насыщении диазометаном окрашивается в ярко-желтый цвет.

Внимание! Приготовление эфирного раствора диазометана и процедуру метилирования необходимо обязательно проводить в работающем вытяжном шкафу.

2.5. Отбор, первичная обработка и хранение проб

Отбор проб для анализа проводят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными 21.08.1979, N 2051-79.

Пробы семян рапса просушивают до стандартной влажности и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.

Пробы масла рапса хранят при +4 - 6 °С в закрытой стеклянной таре.

2.6. Подготовка проб к определению

Пробы семян рапса перед анализом рассыпают на бумаге или кальке и пинцетом удаляют включения. Семена измельчают на лабораторной мельнице и после перемешивания измельченной массы отбирают усредненную аналитическую пробу.

2.7. Проведение определения

2.7.1. Семена рапса

2.7.1.1. Экстракция клопиралида

Аналитическую пробу семян массой 20 +/- 0,1 г помещают в плоскодонную колбу емкостью 300 мл, добавляют 150 мл смеси ацетон:дистиллированная вода (90:10), слегка встряхивают и подвергают обработке ультразвуком в УЗ-бане в течение 10 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр красная лента в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон:дистиллированная вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

При использовании аппарата для встряхивания в плоскодонную колбу с аналитической пробой вносят 150 мл смеси ацетон:дистиллированная вода (90:10) и встряхивают в течение 60 минут. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон:дистиллированная вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель до объема 10 - 20 мл при температуре +40 °С. В колбу-концентратор добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 2,0 мл 5,0%-ного водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре +4 - 6 °С в течение 4 - 5 часов. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "белая лента" в делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 10%-ный водный раствор гидроокиси калия до pH 9 - 10, 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После 15-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта с использованием 50 мл дихлорметана повторяют. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний ацетоно-водный слой сливают в химический стакан емкостью 500 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан:этиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр "синяя лента" со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан:этиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре +40 °С до объема 3 - 5 мл. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом емкостью 10 мл и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре +40 °С.

2.7.1.2. Метилирование клопиралида

В пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного по п. 2.4.5 эфирного раствора диазометана. Пробирку закрывают пробкой и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4 - 6 °С. После этого в пробирку добавляют 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл.

Газохроматографический анализ на содержание клопиралида проводят по п. 2.7.3.

2.7.2. Масло рапса

2.7.2.1. Экстракция клопиралида

Аналитическую пробу масла массой 10,0 +/- 0,1 г растворяют в 50 мл н-гексана (насыщенного ацетонитрилом) в плоскодонной колбе емкостью 100 мл и после этого гексановый раствор масла переносят в делительную воронку емкостью 250 мл. Колбу промывают 50 мл ацетонитрила (насыщенного н-гексаном) и переносят его в воронку. Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний ацетонитрильный слой сливают в колбу-концентратор емкостью 100 мл. Колбу промывают еще 25 мл ацетонитрила (насыщенного н-гексаном) и также переносят в воронку (250 мл). Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут, отстаивают 5 минут и нижний ацетонитрильный слой объединяют с предыдущим. Верхний гексановый слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным ацетонитрильным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель досуха при температуре +50 °С. Сухой остаток растворяют в 20 мл ацетона. К раствору добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 2,0 мл 5,0%-ного водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре +4 - 6 °С в течение 4 - 5 часов. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "белая лента" в делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 10%-ный водный раствор гидроокиси калия до pH 9 - 10, 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После 15-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта с использованием 50 мл дихлорметана повторяют. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний ацетоно-водный слой сливают в химический стакан емкостью 500 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан:этиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр "синяя лента" со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан:этиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре +40 °С до объема 3 - 5 мл. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом емкостью 10 мл и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре +40 °С.

2.7.2.2. Метилирование клопиралида

В пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного по п. 2.4.5 эфирного раствора диазометана. Пробирку закрывают пробкой и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4 - 6 °С. После этого в пробирку добавляют 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл.

Газохроматографический анализ на содержание клопиралида проводят по п. 2.7.3.

2.7.3. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф с ДЭЗ.

Колонка хроматографическая капиллярная длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой ВР-50 (типа OV-17), толщина слоя - 0,5 мкм.

Температура колонки: программирование от 100 °С (3 мин.) до 280 °С (25 мин.) со скоростью 8,0 °С/мин.

Температура испарителя: 240 °С.

Температура детектора: 300 °С.

Расход газов: газа-носителя (азот в/ч) - 1,5 куб. см/мин., дополнительного газа (азот в/ч) к ДЭЗ - 40 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы: 1 мкл.

Время удерживания клопиралида (в виде производного): 14,18 +/- 0,05 мин.

Предел детектирования: 0,1 нг.

Линейный диапазон детектирования: 0,2 - 2,0 нг.

2.7.4. Обработка результатов анализа

Необходимо соблюдать общепринятые правила техники безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами, а также требования, изложенные в документации к приборам.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95 "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

ВНИИ защиты растений.