"МУК 4.1.2015-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств беномила по карбендазиму и карбендазима в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 17.10.2005)

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1.1. Фирма-производитель: Агро-Кеми Кфт.

Торговое наименование: Фундазол.

Действующее вещество: беномил.

Структурная формула (не приводится).

Метил 1-(бутилкарбомоил)бензимидазол-2-илкарбамат (IUPAC).

Гигиенические нормативы для беномила в России:

ОДК в почве - 0,1 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,5 мг/л; ПДК в воздухе рабочей зоны - 0,1 мг/куб. м; МДУ в продукции (мг/кг): сахарная свекла - 0,1; зерно хлебных злаков - 0,5. В винограде, овощных, плодовых, ягодных культурах, семенах и масле сои содержание остаточных количеств не допускается. Для семян и масла подсолнечника гигиенические нормативы в России не установлены.

Область применения препарата. Беномил - фунгицид системного действия с длительным защитным эффектом, эффективно подавляет развитие широкого круга заболеваний растений, вызываемых грибами из классов аскомицетов, базидомицетов и несовершенных грибов на зерновых и овощных культурах, сахарной свекле, виноградниках, в садах, при обработке семян.

1.2. Фирма-производитель: Агро-Кеми Кфт.

Торговое наименование: Колфуго Супер.

Действующее вещество: карбендазим.

Структурная формула (не приводится).

Метилбензимидазол-2-илкарбамат (IUPAC).

Гигиенические нормативы для карбендазима в России:

ОДК в почве - 0,1 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,1 мг/л; ПДК в воздухе рабочей зоны - 0,1 мг/куб. м; МДУ в продукции (мг/кг): сахарная свекла - 0,1 (ВМДУ); зерно хлебных злаков - 0,2. В землянике, смородине, винограде, яблоках, огурцах - содержание остаточных количеств карбендазима не допускается (ВМДУ). Для семян и масла подсолнечника гигиенические нормативы в России не установлены.

Область применения препарата. Карбендазим - фунгицид широкого спектра действия с защитными и целебными свойствами, применяется для борьбы против септориоза, фузариоза, головневых болезней и др. на зерновых культурах, против различных заболеваний плодово-овощных культур, используется для обработки семян перед посевом.

2.1.1. Принцип метода.

Методика основана на определении беномила по карбендазиму и карбендазима методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после извлечения карбендазима из образцов раствором соляной кислоты и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода.

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

2.1.3. Избирательность метода.

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Бумажные фильтры "синяя лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-3716-80.

Карбендазим, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,5%.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Кислота соляная, х.ч., ГОСТ 3118-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - 0,1 М ортофосфорная кислота (10:90 по объему).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Колонка RES ELUT - РН 90А (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (USA).

Воронка Бюхнера, ГОСТ 9147-73.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

рН-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42-861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей.

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2. Кондиционирование колонки.

Перед началом анализа колонку RES ELUT - РН 90А кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов.

Для приготовления подвижной фазы смешивают 100 мл ацетонитрила с 900 мл 0,1 М ортофосфорной кислотой в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют.

Для приготовления 0,1 М раствора соляной кислоты 7,75 мл концентрированной HCl вносят в мерную колбу объемом 1 л, растворяют в 600 мл дистиллированной воды и доводят до метки деионизированным бидистиллятом.

2.5.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску карбендазима (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из стандартного раствора с концентрацией 1,0 мг/мл методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом. После внесения растворитель удаляют током азота.

2.5.5. Построение градуировочного графика.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация карбендазима в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбендазима в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.6.1. Определение карбендазима в масле подсолнечника.

Образец подсолнечного масла массой 20 г растворяют в 100 мл н-гексана, количественно переносят в делительную воронку емкостью 500 мл и экстрагируют карбендазим 0,1 М HCl трижды порциями по 100 мл, встряхивая воронку каждый раз в течение 2 - 3 мин. и отбирая нижний водный слой. Далее очистку проводят по пункту 2.6.4.

2.6.2. Определение беномила в масле подсолнечника.

При определении беномила в масле подсолнечника по карбендазиму проводят два параллельных анализа. В одном пробоподготовку проводят, как описано в п. 2.6.1, в другом - после предварительного гидролиза беномила.

Гидролиз беномила до карбендазима проводят следующим образом. Образец подсолнечного масла массой 20 г растворяют в 100 мл н-гексана, количественно переносят в делительную воронку емкостью 500 мл и экстрагируют беномил с карбендазимом ацетонитрилом трижды порциями по 100 мл, встряхивая воронку каждый раз в течение 2 - 3 мин. и отбирая нижний ацетонитрильный слой. Объединенный ацетонитрильный экстракт промывают дважды в делительной воронке гексаном, порциями по 50 мл (верхний гексановый слой отбрасывают). Ацетонитрильный раствор упаривают до объема 20 - 25 мл на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С, количественно переносят в плоскодонную колбу объемом 500 мл, приливают 300 мл 0,1 М HCl и выдерживают при комнатной температуре в течение суток для полного разложения беномила до карбендазима. Остаток ацетонитрила удаляют на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С, дальнейшую очистку солянокислого экстракта проводят по п. 2.6.5.

2.6.3. Определение карбендазима в семенах подсолнечника.

Навеску измельченных на зерновой мельнице семян подсолнечника массой 20 г помещают в плоскодонную колбу объемом 250 мл, приливают 100 мл 0,1 М HCl и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Экстракцию повторяют еще дважды. Полученный экстракт фильтруют на воронке Бюхнера через фильтр "красная лента". Далее очистку экстракта проводят по п. 2.6.5.

2.6.4. Определение беномила в семенах подсолнечника.

При определении беномила в семенах подсолнечника по карбендазиму проводят два параллельных анализа. В одном пробоподготовку проводят, как описано в п. 2.6.3, в другом - после предварительного гидролиза беномила.

Гидролиз беномила до карбендазима проводят следующим образом: навеску измельченных семян подсолнечника массой 20 г заливают 100 мл 0,1 М HCl и выдерживают при комнатной температуре в течение суток. Полученный экстракт фильтруют на воронке Бюхнера через фильтр "красная лента". Карбендазим экстрагируют 0,1 М HCl порциями по 100 мл дважды на ультразвуковой ванне. Экстракты фильтруют на воронке Бюхнера через фильтр "красная лента" и объединяют с первым. Дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.5.

2.6.5. Очистка экстрактов.

Полученные экстракты промывают в делительной воронке объемом 500 мл дважды гексаном, порциями по 50 мл (верхний гексановый слой отбрасывают) и дважды хлористым метиленом, порциями по 50 мл (нижний дихлорметановый слой отбрасывают), встряхивая каждый раз воронку в течение 3 - 5 минут. К солянокислому раствору добавляют 0,1 М NaOH до рН 10 - 11 (контроль осуществляют рН-метром) и экстрагируют карбендазим хлористым метиленом трижды порциями по 50 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл хлористого метилена. Полученный раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствор вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.6. Условия хроматографирования.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 24871), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Колонка RES ELUT - РН 90А (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (USA).

Температура колонки 30 +/- 1 °С.

Предколонка Waters Symmetry С-18 (20 х 3,9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA), для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1 М ортофосфорная кислота в соотношении 10:90 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 280 нм.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Время удерживания карбендазима 9,2 +/- 0,2 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 1,00 мкг/мл.

2.6.7. Обработка результатов анализа.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание карбендазима в пробе семян или масла (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

Содержание остаточных количеств карбендазима в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбендазима 2 мкг/мл, разбавляют.

Содержание беномила в образцах семян и масла подсолнечника с учетом содержания токсичного метаболита карбендазима (Y, мг/кг) в эквиваленте действующего вещества беномила вычисляют по формуле:

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88). При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

ВИЗР, Санкт-Петербург.