"МУК 4.1.1906-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств спироксамина в зерне и соломе риса методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 01.01.2004)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Байер КропСайенс АГ (Германия).

Торговое название: Фалькон.

Действующее вещество: спироксамин.

8-третбутил-1,4-диоксаспиро[4,5]декан-2-илметил(этил)(пропил)амин (ИЮПАК).

8-(1,1-диметилэтил)-N-этил-N-пропил-1,4-диоксаспиро[4,5]декан-2-метанамин (С.А.).

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 297,5.

Существует в виде смеси диастереоизомеров 1 и 2 в соотношении 49 - 56%; 51 - 44%.

Ниже приведены (если не указано особо) свойства для смеси диастереоизомеров.

Вязкая жидкость бледно-желтого цвета без запаха.

Температура кипения: 120 °С (с разложением).

Давление паров: 9,7 mPa (20 °С) для изомера 1,17 mPa (25 °С) для изомера 2.

Хорошо растворим в органических растворителях: растворимость при 20 °С в ацетоне, гексане, дихлорметане, пропаноле, ацетонитриле, толуоле более 200 г/л. Растворимость (г/л) в воде при 20 °С: при pH 3 - более 200; при pH 7 - 0,47 (изомер 1) и 0,34 (изомер 2); при pH 9 - 0,014 (изомер 1) и 0,01 (изомер 2).

Спироксамин практически нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей и водорослей.

Гигиенические нормативы для спироксамина в России: ОДК в почве - 0,4 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,0025 мг/куб. дм; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,3 мг/куб. м; МДУ для зерна хлебных злаков - 0,2 мг/кг, ВМДУ для винограда - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата:

Спироксамин - системный фунгицид, обладающий защитным, лечебным и искореняющим действием. Эффективен против возбудителей мучнистой росы и ржавчины на зерновых злаках и оидиума на винограде. Чаще всего применяется в комбинациях с другими фунгицидами, особенно триазолами. Спироксамин входит в состав комбинированного фунгицида Фалькон, КЭ, содержащего в 1 л препарата 250 г спироксамина, 167 г тебуконазола и 43 г триадименола. В настоящее время этот препарат проходит регистрационные испытания в России в качестве средства борьбы с пирикуляриозом риса при применении путем авиаобработки.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на газохроматографическом определении спироксамина с ТИД на неподвижной фазе OV-17 после экстракции его из растительного материала водным ацетоном, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с оксидом алюминия.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании риса.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Спироксамин с содержанием д.в. 97,4% (Байер, Германия).

Ацетон, ГОСТ 2603-79.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Этилацетат, ГОСТ 22300-76.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (8:2, по объему).

Алюминия оксид, нейтральный для адсорбционной хроматографии (Реанал, Венгрия), II степени активности по Брокману.

Азот газообразный, о.с.ч., ГОСТ 9293-74.

Водород, получаемый из генератора водорода, ГОСТ 3023-80.

Воздух из баллона, ГОСТ 9010-80.

Стекловата.

Фильтры бумажные синяя лента, ТУ 6-09-1678.

Колонка хроматографическая набивная стеклянная, 2000 х 3 мм, неподвижная фаза - 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм).

Колонка капиллярная ZB-1, 30 м х 0,32 мм х 0,5 мкм, неподвижная фаза SE-30, фирма Phenomenex, США, или аналогичная.

Микрошприц емкостью 10 мкл МШ-10Ф по ТУ 64-1-2850.

Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74.

Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75.

Встряхиватель механический, ТУ 64-1-1081-73.

Иономер ЭВ-74, ГОСТ 22261-76, или аналогичный.

Колонка для адсорбционной хроматографии, 25 х 1,8 см.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79, или аналогичная.

Ротационный испаритель, тип ИР-1М, ТУ 25-11.

Воронка Бюхнера, ГОСТ 9147-73.

Воронки делительные вместимостью 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100 и 250 мл, ГОСТ 9737-70.

Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 мл, ГОСТ 1770-74.

Колбы грушевидные вместимостью 100 и 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74Е.

Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 и 10 мл, ГОСТ 10515-75.

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 1770-74.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Зерно и солому риса подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре. Перед анализом зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице.

2.5.1. Подготовка и кондиционирование колонки

Готовую насадку (3% OV-17 на Хромосорбе W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °С в течение 8 - 10 часов.

Капиллярную колонку с фазой ZB-1 устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 240 °С в течение 8 - 10 часов.

2.5.2. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем гексан последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.3. Приготовление 0,1 М раствора гидроксида натрия

4 г NaOH переносят в мерную колбу емкостью 1 л, добавляют 500 - 600 мл дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения вещества, охлаждают раствор до комнатной температуры и доводят водой до метки.

2.5.4. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор спироксамина с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,0103 г препарата, содержащего 97,4% д.в., в ацетоне в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,25; 0,5; 1,25 и 2,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора спироксамина соответствующим последовательным разбавлением ацетоном. Рабочие растворы хранят в холодильнике не более недели.

2.5.5. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора спироксамина с концентрацией 0,25; 0,5; 1,25 и 2,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение суммарной площади хроматографических пиков изомеров спироксамина для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости суммарной площади хроматографических пиков изомеров в мВ х с от концентрации спироксамина в растворе в мкг/мл.

2.5.6. Подготовка колонки с оксидом алюминия для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 10 г оксида алюминия в 20 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 25 мл смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) и 20 мл гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова для работы.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения спироксамина на колонке с оксидом алюминия

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора спироксамина с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл гексана и наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл гексана, затем 40 мл элюента N 1 (гексан - этилацетат, 8:2) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл гексана и анализируют на содержание спироксамина по п. 2.7.

Фракции, содержащие спироксамин, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 4 мл гексана и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание спироксамина в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: Профиль вымывания спироксамина может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6.1. Экстракция спироксамина

К навеске размолотого зерна (10 г) или соломы (5 г) добавляют 100 мл 70%-ного водного ацетона и суспензию перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл указанного выше водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают половину объема (около 70 мл) раствора, эквивалентного 5 г зерна или 2,5 г соломы. Дальнейшую очистку проводят по п. п. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.2. Очистка экстракта

Отобранные аликвоты растительного экстракта (из п. 2.6.1) упаривают до водной фазы (объем 15 мл) на роторном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в химический стакан вместимостью 100 мл, приливают 20 мл насыщенного раствора хлорида натрия и доводят pH раствора до 8,5 0,1 М раствором гидроксида натрия, контролируя щелочность раствора с помощью иономера. Раствор переносят в делительную воронку емкостью 200 мл, приливают 30 мл гексана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а водную фазу обрабатывают гексаном еще два раза (30 + 20 мл). Объединенный гексановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С.

2.6.3. Очистка на колонке с оксидом алюминия

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов растительного материала, количественно переносят тремя 1-мл порциями гексана в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6).

Колонку промывают 50 мл гексана, которые отбрасывают. Спироксамин элюируют 25 мл смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) и элюат собирают в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл гексана и анализируют на содержание спироксамина по п. 2.7.

2.7.1. Метод ГЖХ с насадочными колонками

Колонка стеклянная спиральная 2000 х 3 мм; неподвижная фаза - 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,125 - 0,150 мм).

Температура детектора 330 °С, инжектора 250 °С, термостата колонки 205 °С.

Скорость потока газа-носителя (азота) - 30 мл/мин., водорода - 11,4 мл/мин., воздуха - 200 мл/мин.

Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Время удерживания спироксамина: 3 мин. 20 сек. (изомер 1) и 3 мин. 57 сек. (изомер 2).

Линейный диапазон детектирования: 0,5 - 5 нг.

Альтернативная неподвижная фаза: 3% OV-61 на Хромосорбе W/HP (0,125 - 0,15 мм); колонка стеклянная 1000 х 3 мм; температура колонки - 180 °С, испарителя - 250 °С, детектора - 330 °С.

Время удерживания спироксамина: 1 мин. 46 сек. (изомер 1) и 2 мин. 7 сек. (изомер 2).

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю суммарную площадь хроматографических пиков изомеров спироксамина.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 2,5 мкг/мл, разбавляют гексаном.

2.7.2. Метод ГЖХ с капиллярными колонками

Хроматограф газовый "Кристалл 2000М" с термоионным детектором.

Колонка капиллярная кварцевая ZB-1, 30 м х 0,32 мм х 0,5 мкм (SE-30).

Температура термостата колонки программированная: начальная температура - 180 °С, выдержка 2 минуты; нагрев колонки по 20°/мин. до температуры 210 °С, выдержка 6 минут; нагрев колонки по 20°/мин. до 250 °С, выдержка 5 минут. Температура термостата испарителя - 250 °С, детектора - 330 °С.

Газовый режим: газ-носитель - азот, общий расход - 22,7 мл/мин.; газ для поддува в детектор - азот, расход - 20 мл/мин. Расход водорода - 11,8 мл/мин., воздуха - 200 мл/мин.

Деление потока: 1:2.

Абсолютное время удерживания спироксамина: 7 мин. 58 сек. (изомер 1), 9 мин. 4 сек. (изомер 2).

Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Линейный диапазон детектирования: 0,25 - 2,5 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю суммарную площадь хроматографических пиков изомеров спироксамина.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 1,0 мкг/мл, разбавляют гексаном.

Содержание спироксамина рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

ВНИИ фитопатологии.