"МУК 4.1.1947-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств дифлубензурона в яблоках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 18.01.2005)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: ЗАО Фирма "Август".

Торговое наименование: Герольд, ВСК.

Действующее вещество: дифлубензурон.

Структурная формула (не приводится).

1-(4-хлорфенил)-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина (IUPAC).

N-{[(4-хлорфенил)амино]карбонил}-2,6-дифторбензамид (С.А.).

Мол. масса: 310,7.

Бесцветное кристаллическое вещество (технический - кристаллы от белых до желтых).

Температура плавления: 228 °С (техн.: 210 - 230 °С).

Растворимость (г/л) при 20 °С: н-гексан - 0,063; толуол - 0,29; дихлорметан - 1,8; метанол - 1,1; вода - 0,08 мг/л (при pH 7 и 25 °С).

Мутагенный и онкогенный эффекты при использовании препарата не наблюдались.

Гигиенические нормативы для дифлубензурона в России:

ОДК в почве - 0,2 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,01 мг/л; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 3,0 мг/куб. м; МДУ для яблок - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата: Несистемный регулятор роста насекомых с контактным и кишечным действием. Используется для уничтожения широкого диапазона насекомых-вредителей, питающихся листьями лесных и плодовых деревьев, а также плодами. Эффективен против яблонной плодожорки, листоверток и др.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении дифлубензурона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бикарбонат натрия, х.ч., ГОСТ 4201-79.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Дифлубензурон, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9%.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 2631-019-44493179-98.

Диэтиловый эфир, ч., ОСТ 84-2006-88.

Железо (II) сернокислое, х.ч., ГОСТ 4148-78.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная, имп. (Ferak, Германия) или х.ч., ГОСТ 6552-80.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (56:44, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 - 0,063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - диэтиловый эфир (80:20, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан - диэтиловый эфир (55:45, по объему).

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или аналогичный.

Колонка Symmetry-C18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Предколонка Waters Symmetry C-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25 х 1) см.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21.08.79, N 2051-79. Пробы яблок хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С, перед проведением анализа пробы гомогенизируют в гомогенизаторе.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Диэтиловый эфир (1 л) предварительно встряхивают с 20 мл свежеприготовленного раствора железного купороса (30 г сульфата железа в 55 мл воды с добавлением 1,5 г концентрированной серной кислоты). Затем диэтиловый эфир последовательно промывают 0,5%-ным раствором перманганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Ацетонитрил (х.ч.) сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

2.5.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску дифлубензурона (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил - бидистиллированная вода (56:44, по объему). Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

2.5.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация дифлубензурона в растворе) в хроматограф вводят по 20 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан - диэтиловый эфир (80:20, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 мл смеси гексан - диэтиловый эфир (55:45, по объему) и 30 мл смеси гексан - диэтиловый эфир (80:20, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения дифлубензурона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора дифлубензурона с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также наносят на колонку. Промывают колонку 60 мл элюента N 1, затем 60 мл элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание дифлубензурона по п. 2.6.3.

Фракции, содержащие дифлубензурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.3. Рассчитывают содержание дифлубензурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: профиль вымывания дифлубензурона может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.8. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6.1. Определение дифлубензурона в яблоках

Навеску массой 20 г гомогенизированных в гомогенизаторе яблок помещают в коническую колбу емкостью 100 мл и экстрагируют дифлубензурон 40 мл 60%-ного водного ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды порциями по 30 мл. Объединенный экстракт концентрируют на роторном испарителе при температуре 40 °С до объема ~50 мл.

Дифлубензурон переэкстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 мл, встряхивая делительную воронку в течение 2 - 3 мин. Верхний водный слой отбрасывают <*>. Объединенный экстракт промывают в делительной воронке дважды 0,1 М раствором бикарбоната натрия порциями по 30 мл и один раз 50 мл 0,02 М раствора ортофосфорной кислоты, встряхивая воронку в течение 2 - 3 минут (при всех промывках верхний водный слой отбрасывают). Органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл хлористого метилена. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.2.

2.6.2. Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.1 экстрактов яблок, количественно переносят тремя порциями (по 3 мл) смеси гексан - диэтиловый эфир (80:20, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 60 мл элюента N 1, который отбрасывают. Дифлубензурон элюируют 60 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка Symmetry-C18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Температура колонки 30 +/- 1 °С.

Предколонка Waters Symmetry C-18 для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 56:44 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 260 нм.

Объем вводимой пробы 20 мкл.

Время удерживания дифлубензурона 11,6 +/- 0,2 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,00 мкг/мл.

2.6.4. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание дифлубензурона в образце яблок (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств дифлубензурона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дифлубензурона 2 мкг/мл, разбавляют.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

ВИЗР, Санкт-Петербург.