"МУК 4.1.1833-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств беномила по карбендазиму и карбендазима в винограде методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 13.02.2004)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1.1. Фирма-производитель: Агро-Кеми Кфт.

Торговое наименование: Фундазол.

Действующее вещество: беномил.

Структурная формула: (не приводится).

Гигиенические нормативы для беномила в России:

МДУ в винограде - содержание остаточных количеств не допускается. Область применения препарата. Беномил - фунгицид системного действия с длительным защитным эффектом, эффективно подавляет развитие широкого круга заболеваний растений, вызываемых грибами из классов аскомицетов, базидомицетов и несовершенных грибов на зерновых и овощных культурах, сахарной свекле, виноградниках, в садах, при обработке семян.

1.2. Фирма-производитель: Агро-Кеми Кфт.

Торговое наименование: Колфуго Супер.

Действующее вещество: карбендазим.

Структурная формула: (не приводится).

Гигиенические нормативы для карбендазима в России:

МДУ в винограде - содержание остаточных количеств не допускается.

Область применения препарата. Карбендазим - фунгицид широкого спектра действия с защитными и целебными свойствами, применяется для борьбы против септориоза, фузариоза, головневых болезней и др. на зерновых культурах, против различных заболеваний плодово-овощных культур, используется для обработки семян перед посевом.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении беномила по карбендазиму и карбендазима методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после извлечения карбендазима из образцов раствором соляной кислоты и очистки путем перераспределения между двумя жидкими фазами.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Бумажные фильтры "синяя лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Карбендазим, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,5%.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Кислота соляная, х.ч., ГОСТ 3118-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - 0,1М ортофосфорная кислота (10:90, по объему).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Этилацетат, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором и термостатом колонки, или аналогичный.

Колонка RES ELUT - РН 90А (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (USA).

Воронка Бюхнера, ГОСТ 9147-73.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42-861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы ягод винограда хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы сока хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 3 суток, при температуре -18 °С - в течение месяца (в пластиковых бутылях).

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетонитрил сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку RES ELUT - РН 90А кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления подвижной фазы смешивают 100 мл ацетонитрила с 900 мл бидистиллированной воды в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют.

2.5.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску карбендазима (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2, 0,5 и 1,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При определении полноты извлечения беномила и карбендазима из винограда для внесения в контрольный образец используют стандартный раствор, разбавленный ацетонитрилом до требуемой концентрации методом последовательного разбавления.

2.5.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация карбендазима в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбендазима в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6.1. Определение карбендазима в соке

Образец предварительно отфильтрованного на воронке Бюхнера через фильтр "синяя лента" сока объемом 20 мл количественно переносят в делительную воронку емкостью 250 мл, добавляют 80 мл 0,1М HCl. Далее очистку проводят по п. 2.6.3.

2.6.2. Определение карбендазима в ягодах винограда

Навеску ягод винограда массой 100 г гомогенизируют в гомогенизаторе, помещают в плоскодонную колбу объемом 1 л, приливают 500 мл 0,1М HCl и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Экстракцию повторяют еще дважды. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту, соответствующую 20 г ягод, экстракт фильтруют на воронке Бюхнера через фильтр "красная лента". Далее очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

2.6.3. Очистка экстрактов

Полученные экстракты промывают в делительной воронке объемом 250 мл дважды гексаном порциями по 50 мл (верхний гексановый слой отбрасывают) и дважды этилацетатом порциями по 20 мл (верхний этилацетатный слой отбрасывают), встряхивая каждый раз воронку в течение 3 - 5 минут. К солянокислому раствору добавляют 0,1М NaOH до pH 10 - 11 (контроль осуществляют pH-метром) и экстрагируют карбендазим этилацетатом трижды порциями по 50 мл. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл этилацетата. Полученный раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Колонка RES ELUT - РН 90А (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (USA).

Температура колонки 30 +/- 1 °С.

Предколонка Waters Symmetry С-18 (20 х 3,9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1М ортофосфорная кислота в соотношении 10:90 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 280 нм.

Объем вводимой пробы 20 мкл.

Время удерживания карбендазима 9,2 +/- 0,2 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 1,00 мкг/мл.

2.6.5. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание беномила по карбендазиму и карбендазима в образцах винограда или виноградного сока (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств карбендазима в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбендазима 2 мкг/мл, разбавляют.

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

ВИЗР, Санкт-Петербург.