"МУК 4.1.1966-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств протиоконазола по его основному метаболиту протиоконазол-дестио в зерне и соломе зерновых колосовых культур методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 21.04.2005)

Действующее вещество: протиоконазол (JAU 6476).

2-[(2RS)-2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-2H-1,2,4-триазол-3(4H)-тион (ИЮПАК).

2-[2-(1-хлорциклопропил)-3-(2-хлорфенил)-2-оксипропил]-1,2-дигидро-3H-1,2,4-триазол-3-тион (С.А.).

Структурная формула (не приводится).

Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей, дафний и почвенных микроорганизмов.

Основной метаболит протиоконазола: протиоконазол-дестио (SXX 0665).

Альфа-(1-хлорциклопропил)-альфа-(2-хлорфенил)метил-1H-1,2,4-триазол-1-этанол (С.А.).

Другие физико-химические и токсикологические характеристики протиоконазол-дестио отсутствуют.

Гигиенические нормативы для протиоконазола и протиоконазол-дестио в России не установлены.

Область применения препарата

Протиоконазол - фунгицид системного действия из группы ингибиторов синтеза эргостерина. Вещество обладает защитным, искореняющим и лечебным действием. При обработке вегетирующих растений оно эффективно подавляет развитие возбудителей ржавчины, мучнистой росы, септориоза, фузариоза колоса, ломкости стеблей и пятнистостей листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью.

Протиоконазол весьма лабильное вещество и при поступлении в растение очень быстро метаболизируется до более устойчивого соединения - протиоконазол-дестио (альфа-(1-хлорциклопропил)-альфа-(2-хлорфенил)метил-1H-1,2,4-1-этанол) (SXX 0665). В связи с этим разработан метод, позволяющий осуществлять контроль за содержанием остаточных количеств протиоконазола в зерне и соломе зерновых колосовых культур по протиоконазол-дестио.

Методика основана на газохроматографическом определении протиоконазол-дестио (SXX 0665) с ЭЗД на неподвижной фазе OV-17 после экстракции его из растительного материала водным ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия и концентрирующем патроне Диапак-диол.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания зерновых колосовых культур.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79).

Отобранные пробы зерна и соломы досушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре или в холодной комнате при температуре 4 °C. Перед анализом зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице.

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Этилацетат промывают равным объемом 5%-го раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Оксид алюминия III степени активности по Брокману получают добавлением 4,6% воды к навеске оксида алюминия фирмы Мерк (Германия) I степени активности.

Готовую насадку (3% OV-17 на Хромосорбе W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °C в течение 8 - 10 ч.

Основной стандартный раствор протиоконазол-дестио с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,0102 г вещества, содержащего 98,5% д.в., в этилацетате в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12 °C не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора метаболита соответствующим последовательным разведением этилацетатом.

При изучении полноты открывания протиоконазол-дестио в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ x с от концентрации протиоконазол-дестио в растворе в мкг/мл.

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 0,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г оксида алюминия III степени активности по Брокману в 20 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 15 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают сначала с помощью медицинского шприца 10 мл смеси дихлорметан-ацетон (1:1, по объему), а затем 8 мл смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) со скоростью 5 мл/мин.

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора протиоконазол-дестио с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель потоком теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и наносят на подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 30 мл элюента N 1 (смесь гексан-этилацетат, 85:15) и затем 30 мл элюента N 2 (смесь гексан-этилацетат, 70:30) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют на содержание протиоконазол-дестио по п. 2.7.

Фракции, содержащие протиоконазол-дестио, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл этилацетата и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Профиль вымывания протиоконазол-дестио может меняться при использовании новых партий сорбента и растворителей.

К навеске размолотого зерна (20 г) или соломы (5 г) добавляют 100 мл 70%-го водного ацетона и суспензию, перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл 70%-ного водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (соответственно около 35 и 25 мл), эквивалентную 5 г зерна или 1 г соломы. Дальнейшую очистку проводят по пп. 2.6.2, 2.6.3 и 2.6.4.

Отобранные аликвоты растительного экстракта (из п. 2.6.1) упаривают до водной фазы (объем около 5 мл) на роторном испарителе при температуре 40 °C. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 20 мл бидистиллированной воды, 30 мл дихлорметана и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а водную фазу обрабатывают дихлорметаном еще два раза (30 + 20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °C.

К остатку в колбе, полученному при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов растительного материала, приливают 3 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) и помещают в ультразвуковую баню на 3 минуты. Раствор переносят в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 25 мл смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему), которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 25 мл смеси гексан-этилацетат (70:30, по объему) в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °C. Сухой остаток экстракта зерна растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по п. 2.7. Экстракт соломы подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне Диапак-диол.

Сухой остаток экстракта соломы из п. 2.6.3 переносят двумя 1-мл порциями смеси гексан-дихлорметан (7:3, по объему) в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 2.5.5). Патрон промывают 5 мл смеси гексан-дихлорметан (1:1, по объему) со скоростью 5 мл/мин., которые отбрасывают. Протиоконазол-дестио элюируют 12 мл дихлорметана. Элюат упаривают досуха в грушевидной колбе емкостью 50 мл на роторном испарителе при температуре 30 °C. Для удаления следовых количеств дихлорметана в колбу приливают 5 мл гексана и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата и анализируют по п. 2.7.

Колонка хроматографическая, стеклянная, 1000 х 3 мм, неподвижная фаза - 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм).

Температура детектора - 320 °C, испарителя - 270 °C, термостата колонки - 230 °C.

Скорость потока газоносителя (азот) - 30 мл/мин.; поддув - 25 мл/мин.

Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Время удерживания протиоконазол-дестио - 2 мин. 28 с.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют этилацетатом.

Содержание протиоконазол-дестио рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

A - концентрация стандартного раствора протиоконазол-дестио, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m - масса анализируемой части образца, г (для зерна - 5 г, для соломы - 1 г).

При установлении уровня протиоконазола полученное значение содержания протиоконазола-дестио (X) умножают на 1,1.

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Разработчики: Дубовая Л.В., Макеев А.М.

ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.