"МУК 4.2.1775-03. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma viride 44-11-62/3 - продуцента комплекса целлюлолитических ферментов в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания"
(утв. Минздравом России 24.10.2003)

1. Разработаны Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).

2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.

3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма - Trichoderma viride 44-11-62/3 - продуцента комплекса целлюлолитических ферментов (целлюлаза, ксиланаза) в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".

На агаризованной среде сусло-агар (содержание солодового сусла 5 - 6° по Баллингу) на 5 день развития микроорганизм образует характерные колонии до 5,0 - 5,5 см в диаметре с гладкой подошвой, слегка приподнятые над поверхностью среды, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами лимонно-желтого цвета. На 3 день развития в среду выделяется ярко-желтый пигмент лимонного оттенка. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые.

Систематическое положение микроорганизма

Штамм Trichoderma viride 44-11-62/3 получен во ВНИИбиотехнология в лаборатории Биосинтеза ферментов методом индуцированной селекции с применением этиленимина и нитрозометилмочевины из исходной культуры Trichoderma viride 44 - продуцента целлюлазы и депонирован в ЦМПМ ВНИИгенетика.

Штамм-продуцент синтезирует высокоактивный комплекс целлюлолитических ферментов для производства ферментного препарата целловиридин Г3х. Максимальная активность целлюлазы составляет 35 ед./мл, ксиланазы - 42 ед./мл.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Культивирование гриба происходит 5 суток при температуре 36 - 38 °С, затем 5 суток при комнатной температуре. Для размножения и хранения используется сусло-агар 5 - 6 °Б, рН среды - 5,0 - 6,0.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 200 кл./куб. м, пометка А.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Прямой метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия) на поверхность плотной питательной среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по культурально-морфологическим признакам на день развития.

Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма, как результат продукции целлюлазы на среде с окрашенной целлюлозой.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования:

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

Для определения концентрации клеток штамма-продуцента воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента (прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента, косвенный - до 30 - 50 колоний на чашке).

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

При выполнении анализа воздуха прямым методом среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют молочной кислоты из расчета 0,4 мл на 100 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

При выполнении анализа воздуха косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 42 °С (для интенсификации развития гриба). Через 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной пигментации среды (прямой метод) или зон просветления вокруг выросших колоний продуцента (косвенный метод) как результат продукции целлюлолитических ферментов на среде с окрашенной целлюлозой.

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

где:

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96. М., 1991. 693 с.

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

5. ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.

6. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. 122 с.