"МУК 4.1.2054-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств Прохлораза в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 10.04.2006)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур массовой концентрации Прохлораза в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг, 0,15 - 1,5 мг/кг, 0,025 - 0,25 мг/кг, 0,05 - 0,5 мг/кг соответственно.

Прохлораз - действующее вещество препарата Мираж, КЭ (450 г/л), фирма-производитель: Мактешим-Аган.

N-пропил-N-[2-(2,4,6-трихлорофенокси)-этил]имидазол-1-карбоксамид.

Структурная формула (не приводится).

Мол. масса: 376,7.

Химически чистый Прохлораз представляет собой бесцветный кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления - 46,5 - 49,30 °С.

Давление паров 90 мПа (при 20 °С).

Область применения препарата:

Прохлораз - системный фунгицид защитного и искореняющего действия из группы производных азола, высокоэффективно подавляет развитие возбудителей болезней растений из родов Pseudocercosporella, Pyrenophora, Septoria, Alternaria, Botrytis, Fusarium и др. в посевах зерновых, овощных, технических культур и в плодовых садах при нормах расхода 400 - 600 г д.в. на га.

Зарегистрирован в России под торговым названием Мираж (45% к.э.) для применения на зерновых культурах против септориоза, мучнистой росы, фузариоза колоса, сетчатой пятнистости и ринхоспориоза с нормой расхода 1 л/га до двух обработок за сезон.

В России установлены следующие гигиенические нормативы: ОДК в почве (мг/кг) - 0,3, ОДУ в воде водоемов (мг/л) - 0,05 (санитарно-токсикологический), ОБУВ в воздухе рабочей зоны (мг/куб. м) - 0,1, МДУ в продукции (мг/кг): зерно хлебных злаков - 0,05.

Вода

Предел обнаружения: 0,025 мг/кг

Диапазон определяемых концентраций: 0,025 - 0,25 мг/кг

Среднее значение извлечения: 89,9%

Стандартное отклонение: 0,54%

Доверительный интервал среднего результата: + 1,13%

Почва

Предел обнаружения: 0,15 мг/кг

Диапазон определяемых концентраций: 0,15 - 1,5 мг/кг

Среднее значение извлечения: 78,3%

Стандартное отклонение: 0,67%

Доверительный интервал среднего результата: + 1,40%

Зерно

Предел обнаружения: 0,025 мг/кг

Диапазон определяемых концентраций: 0,025 - 0,25 мг/кг

Среднее значение извлечения: 81,0%

Стандартное отклонение: 0,40%

Доверительный интервал среднего результата: + 0,85%

Солома

Предел обнаружения: 0,05 мг/кг

Диапазон определяемых концентраций: 0,05 - 0,5 мг/кг

Среднее значение извлечения: 74,0%

Стандартное отклонение: 0,53%

Доверительный интервал среднего результата: + 1,12%

Методика основана на определении Прохлораза методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, концентрирования экстракта упариванием в вакууме, очистки путем перераспределения между водной и органической фазами. Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В прилагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании зерновых.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостной хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии, очистка бидистиллированной воды для приготовления подвижной фазы, приготовление стандартных растворов, приготовление растворов для жидкостной хроматографии (приготовление подвижной фазы), построение калибровочного графика.

7.1. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

Колонку Zorbax SB-С18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при t = 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин. в течение 3 - 4 часов.

7.2. Очистка бидистиллированной воды для приготовления подвижной фазы

2 литра бидистиллята из дистиллятора наливают в круглодонную колбу объемом 3 - 3,5 л, добавляют в нее 2 г марганцовокислого калия и перемешивают жидкость до полного растворения порошка. Колбу помещают на нагреватель, доводят воду до кипения и кипятят в течение 6 часов. По истечении времени колбу подсоединяют к холодильнику и воду перегоняют при постоянной температуре. Подготовленную таким образом воду хранят в темной посуде с хорошо подогнанной пробкой.

7.3. Приготовление стандартных растворов

Взвешивают 50 мг Прохлораза в мерной колбе объемом 50 мл. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом (стандартный раствор N 1, концентрация Прохлораза - 1 мг/мл). Затем 1 мл стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой в мерную колбу объемом 100 мл и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании (стандартный раствор N 2, концентрация Прохлораза - 10 мкг/мл). Стандартные растворы N 1 и 2 можно хранить в холодильнике в течение 3-х и 1-го месяцев соответственно.

Ежедневно перед анализом методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 1; 0,5; 0,2; 0,1 мкг/мл вещества, и используют эти растворы для построения калибровочного графика и внесения в контрольный образец при отработке методики.

7.4. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии

7.4.1. Приготовление подвижной фазы

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил и очищенную по п. 7.2 дистиллированную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 750 мл ацетонитрила и 250 мл воды. Смесь тщательно перемешивают, затем пропускают через нее гелий со скоростью 20 мл/мин. в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенного гелия на 1 минуту. Полученный раствор используют в качестве подвижной фазы.

7.5. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно 3 раза по 20 мкл каждого из полученных четырех растворов, измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят график зависимости площади пика от концентрации Прохлораза (мкг/мл).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторной мельнице.

Пробу воды объемом 100 мл помещают в делительную воронку емкостью 250 мл и трижды экстрагируют гексаном порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 1 - 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний гексановый слой сливают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия. Объединенный экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 5 - 25 мл ацетонитрила и 20 мкл раствора вводят в хроматограф.

Образец почвы массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, добавляют 5 мл дистиллированной воды, встряхивают колбу до полного смешивания и дают выстояться в течение 10 минут. Затем в колбу прибавляют 30 мл ацетона и встряхивают на механическом встряхивателе в течение 10 мин. Содержимое колбы переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2500 об./мин. 5 мин. Супернатант фильтруют в концентратор объемом 250 мл через фильтр "красная лента". Почву из центрифужного стакана возвращают обратно в коническую колбу и Прохлораз экстрагируют еще раз, используя 30 мл ацетона и встряхивая колбу в течение 10 мин., с обязательным последующим центрифугированием. Экстракты объединяют в концентраторе объемом 250 мл. Объединенный экстракт выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 3 мл ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют 50 мл дистиллированной воды и 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия и переносят содержимое концентратора в делительную воронку объемом 250 мл. После этого в воронку приливают 20 мл гексана, интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. Дают жидкости отстояться и после разделения слоев верхнюю гексановую фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Нижнюю фракцию возвращают в делительную воронку и повторяют операцию еще 2 раза, используя по 20 мл гексана каждый раз. По окончании экстракции осушитель промывают 10 мл гексана. Гексановые экстракты объединяют в концентраторе, а водную фракцию отбрасывают. Объединенный гексановый экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°.

Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетона, тщательно обмывая стенки колбы, добавляют туда же 50 мл дистиллированной воды и 25 мл 0,1 н раствора соляной кислоты. Затем содержимое концентратора переносят в делительную воронку объемом 250 мл, добавляют туда же 20 мл гексана и интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После разделения слоев верхнюю гексановую фракцию отбрасывают, нижний водный слой возвращают в делительную воронку и еще раз промывают 20 мл гексана (после разделения слоев верхнюю гексановую фракцию отбрасывают). К водному остатку добавляют 10 - 15 мл 5%-ного водного раствора бикарбоната натрия (до pH 7) и трижды реэкстрагируют Прохлораз гексаном, используя каждый раз по 20 мл и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения слоев верхнюю гексановую фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия, осушитель промывают 10 мл гексана и также собирают в концентратор. Водную фракцию отбрасывают. Объединенный гексановый экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°. Сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и вводят в хроматограф 20 мкл раствора.

Образец размолотого зерна массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 30 мл ацетонитрила и встряхивают на механическом встряхивателе в течение 15 мин. Экстракт фильтруют в концентратор объемом 250 мл через бумажный фильтр "красная лента". Прохлораз экстрагируют еще 2 раза порциями по 30 мл ацетонитрила в течение 15 мин. Экстракты объединяют в концентраторе. Объединенный экстракт выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 3 мл ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют туда же 50 мл дистиллированной воды, 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия и 10 мл 5%-ного раствора бикарбоната натрия. Содержимое концентратора переносят в делительную воронку объектом 250 мл. Прохлораз трижды реэкстрагируют гексаном, используя каждый раз по 20 мл и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения слоев верхнюю гексановую фракцию собирают в химический стакан объемом 100 мл. Водную фракцию отбрасывают.

Объединенный гексановый экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 мл и Прохлораз из гексана экстрагируют трижды ацетонитрилом порциями по 20 мл, интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в химический стакан объемом 100 мл. Гексан отбрасывают.

Объединенный ацетонитрильный экстракт переносят в делительную воронку объемом 250 мл, добавляют туда же 20 мл гексана и интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор объемом 250 мл, пропуская через химическую воронку с 10 г безводного сульфата натрия (осушитель промывают 10 мл ацетонитрила и объединяют с экстрактом). Гексан отбрасывают. Ацетонитрил выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°.

Сухой остаток растворяют в 3 мл ацетона, добавляют 20 мл дистиллированной воды, 30 мл 0,1 н раствора соляной кислоты и помещают в делительную воронку объемом 250 мл. Туда же прибавляют 20 мл гексана и интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают, нижний водный слой возвращают в делительную воронку и добавляют туда же 15 мл 5%-ного раствора бикарбоната натрия (до pH 7).

Прохлораз экстрагируют гексаном, используя каждый раз по 20 мл и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения слоев верхнюю гексановую фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия, осушитель промывают 10 мл гексана и также собирают в концентратор. Водную фракцию отбрасывают. Объединенный гексановый экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°. Сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и вводят в хроматограф 20 мкл раствора.

Образец измельченной соломы массой 5 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 50 мл ацетона и встряхивают на механическом встряхивателе в течение 5 мин. Экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 мл через бумажный фильтр "красная лента". Прохлораз экстрагируют еще 3 раза порциями по 50, 20 и 20 мл ацетона в течение 5 мин. Экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 мл и помещают на ночь в холодильник. На следующий день объединенный экстракт фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в концентратор объемом 250 мл и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 3 мл ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют туда же 50 мл дистиллированной воды и 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Содержимое концентратора переносят в делительную воронку объемом 250 мл. Прохлораз трижды экстрагируют гексаном, используя каждый раз по 20 мл и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения слоев верхнюю гексановую фракцию собирают в концентратор объемом 250 мл. Водную фракцию отбрасывают. Объединенный гексановый экстракт выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 50 мл ацетонитрила и переносят в делительную воронку объемом 250 мл. К экстракту в делительной воронке добавляют 20 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в химический стакан объемом 100 мл. Гексан отбрасывают. Ацетонитрильную фракцию возвращают в делительную воронку и еще раз промывают 20 мл гексана. Гексан отбрасывают. Ацетонитрил собирают в концентратор объемом 100 мл и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетона, добавляют 50 мл дистиллированной воды и 25 мл 0,1 н соляной кислоты и переносят в делительную воронку объемом 250 мл. К раствору в делительной воронке прибавляют 20 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев гексан отбрасывают. Процедуру повторяют еще 2 раза. К водному слою в делительной воронке прибавляют 15 мл 5%-ного раствора бикарбоната натрия (до pH 7). Прохлораз экстрагируют гексаном, используя каждый раз по 20 мл и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения слоев верхнюю гексановую фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия, осушитель промывают 10 мл гексана и также собирают в концентратор. Водную фракцию отбрасывают. Объединенный гексановый экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30°. Сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и вводят в хроматограф 20 мкл раствора.

Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.

Колонка стальная Zorbax SB-С18, 4,6 мм х 25 см.

Температура колонки 25 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода 75:25 по объему.

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 240 нм.

Чувствительность 0,0025 ед. оптической плотности на шкалу.

Объем вводимой пробы 20 мкл.

Время удерживания Прохлораза - 6,6 - 6,9 мин.

Линейный диапазон детектирования 2 - 20 нг.

Альтернативная колонка: Lichrosorb RP 18, зернение 5 мкм.

Подвижная фаза: ацетонитрил-10 мМ фосфатный буфер, pH 3 (55:45, по объему).

Рабочая длина волны: 228 нм.

Время удержания Прохлораза - 14,6 - 15,4 мин.

Содержание Прохлораза рассчитывают по формуле:

где:

Х - содержание Прохлораза в пробе, мг/кг или мг/л;

Sст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

Sпр - высота (площадь) пика образца, мм;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m - масса анализируемого образца, г (мл);

P - содержание Прохлораза в аналитическом стандарте, %.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева. Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".