"МУК 4.1.1854-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств флутриафола в зерне гороха, семенах и масле подсолнечника методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 05.03.2004)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-регистрант: Кеминова А/С.

Торговое наименование: Импакт, Винцит.

Действующее вещество: флутриафол.

Структурная формула (не приводится).

CA: (+/-)-альфа-(2-фторфенил)-альфа-(4-фторфенил)-1Н-1,2,4-триазол-1-этанол.

Мол. масса: 301,3.

Химически чистый препарат - твердое белое кристаллическое вещество.

Растворимость (20 °С): в воде - 130 мг/л, в ацетоне - 190 г/л, дихлорметане - 150 г/л, метаноле - 69 г/л, гексане - 0,3 г/л.

Гигиенические нормативы, МДУ (мг/кг): зерно хлебных злаков, свекла сахарная - 0,1, виноград - н.д., яблоки - 0,1 <*>. Для зерна гороха, семян и масла подсолнечника гигиенические нормативы не установлены.

Область применения: фунгицид широкого спектра действия для борьбы с болезнями листа и колоса зерновых культур, также применяется для защиты плодовых, зернобобовых и других культур. Используется для борьбы с почвенными, семенными и аэрогенными инфекциями.

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Метод определения флутриафола в растительных субъектах основан на экстракции пестицида органическими растворителями и очистке перераспределением между двумя несмешивающимися жидкими фазами, а также при необходимости на колонке с силикагелем. Количественное определение проводят методом газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора (ТИД).

2.1.2. Избирательность метода

Избирательность метода обеспечивается очисткой экстрактов анализируемых проб и сочетанием условий хроматографирования. Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

2.2. Реактивы, материалы

Флутриафол, аналитический стандарт (фирма "Кеминова А/С").

Ацетон, о.с.ч. 9 - 5, ТУ 2633-039-4493179-00, или ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-76.

н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.

Натрий сернокислый безводный, ч.д.а., ГОСТ 4166-76.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Стекловата.

Силикагель L 100/400 для хроматографии (0,040 - 0,063 мм) (Хемапол, Венгрия).

Серная кислота ОСЧ 11-5, ГОСТ 14262-78.

Хлористый метилен, ч.д.а., ТУ-2631-020-11291058-96.

2.3. Приборы и посуда

Газовый хроматограф Цвет-550 М или аналогичный с ТИД и стеклянной насадочной колонкой длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Весы технические ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-80.

Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Микрошприц МШ-10, МШ-10М, ТУ 2-833-106.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82,

Воронки делительные на 500, 1000 мл ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100 куб. см, 500 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Стаканы химические, ГОСТ 25336-82Е.

Колонка стеклянная хроматографическая длиной 30 см, диаметром 10 мм.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Для длительного хранения зерно и семена подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна и семян измельчают. Масло хранят в холодильнике.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с общепринятыми методиками. Гексан и дихлорметан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции, затем промывают водой, после чего сушат над щелочью и перегоняют.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку, заполненную хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5% SE-30, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °С в течение 8 - 10 часов.

2.5.3. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Основной раствор флутриафола готовят, количественно перенося 10 мг аналитического стандарта флутриафола в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетоне. Из полученного раствора флутриафола с концентрацией 100 мкг/мл готовят рабочие растворы с концентрациями 1 мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 мкг/мл, 10 мкг/мл последовательным разведением в ацетоне.

Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют соответствующий стандартный раствор флутриафола в ацетоне.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика зависимости высоты (площади) пика от концентрации флутриафола в растворе в хроматограф вводят по 1 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты (площади) пиков и строят график зависимости среднего значения высоты, мм (площади, мв/сек) пика от концентрации флутриафола в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

Силикагель прогревают в термостате при 120 °С в течение 3-х часов и охлаждают до комнатной температуры. На дно стеклянной колонки помещают стекловату, слой 0,5 см безводного сульфата натрия и заполняют через воронку суспензией 5 г силикагеля в 25 мл гексана при открытом кране колонки, сверху наносят слой 1 см безводного сульфата натрия. Затем колонку промывают 10 мл смеси гексан:ацетон в соотношении 3:2 и закрывают кран, когда уровень растворителя достигнет верхнего края сорбента. Колонка готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения флутриафола на колонке с силикагелем

В подготовленную колонку пипеткой вносят 1 мл стандартного раствора флутриафола и дают впитаться. После этого в колонку вносят 10 мл смеси гексан:ацетон (1:3), элюат отбрасывают. Флутриафол элюируют 40 мл смеси гексан:ацетон (1:5), отбирая фракции по 5 мл, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 мл ацетона и хроматографируют фракции, содержащие флутриафол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 мл ацетона и хроматографируют. Рассчитывают содержание флутриафола в элюате, определяя его полноту извлечения из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: профиль вымывания флутриафола может изменяться при использовании силикагеля новой партии или другой марки.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Экстракция и очистка экстрактов

2.6.1.1. Зерно гороха. Навеску размолотого в лабораторной мельнице гороха (20 г) помещают в коническую колбу объемом 250 мл и экстрагируют флутриафол 50 мл ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Надосадочную жидкость фильтруют через складчатый фильтр "красная лента" в делительную воронку объемом 500 мл. Экстракцию повторяют дважды порциями по 50 мл ацетона. После третьей экстракции осадок переносят на фильтр, колбу ополаскивают 20 мл ацетона и 50 мл дистиллированной воды и фильтруют смывы через фильтр с осадком. К объединенному экстракту добавляют 50 мл дистиллированной воды и промывают 10 мл гексана, встряхивая делительную воронку в течение 2-х минут. После полного разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают и промывку повторяют дважды порциями по 10 мл гексана. Промытый гексаном водно-ацетоновый экстракт концентрируют на роторном испарителе до объема 130 - 150 мл и переносят в делительную воронку, ополаскивая концентратор. Переэкстрагируют флутриафол в хлористый метилен трижды порциями по 50 мл, встряхивая воронку в течение 2-х минут. Нижний органический слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия, промывают осушитель 10 мл хлористого метилена. Объединенный дихлорметановый экстракт упаривают досуха и растворяют в 1 - 2 мл ацетона. При необходимости проводят очистку на колонке с силикагелем, по п. 2.6.2.

2.6.1.2 Семена подсолнечника. Навеску очищенных от лузги и размолотых на лабораторной мельнице семян (20 г) помещают в коническую колбу объемом 500 мл и экстрагируют флутриафол 150 мл охлажденной смеси гексан:ацетон в соотношении 2:1 на ультразвуковой установке в течение 15 мин. (ванна установки заполнена водой со льдом). Экстракт фильтруют через складчатый фильтр "белая лента" в делительную воронку объемом 1000 мл. Экстракцию повторяют дважды порциями экстрагента по 150 мл, после чего остаток переносят на фильтр, колбу и осадок промывают 20 - 30 мл экстрагирующей смеси. К объединенному экстракту в делительную воронку добавляют 100 мл дистиллированной воды и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения фаз нижний водно-ацетоновый объем собирают, при этом эмульсию пограничного слоя разбивают непосредственно перед тем, как предстоит отбор эмульсионного слоя, внесением в него очень малого количества хлористого натрия. Оставшийся в делительной воронке гексановый слой промывают дважды 50 мл водного ацетона (50:50), который собирают. Объединенный водно-ацетоновый экстракт упаривают на роторном испарителе до объема 150 - 180 мл и переносят в делительную воронку. Флутриафол переэкстрагируют в хлористый метилен трижды порциями по 50 мл, встряхивая делительную воронку в течение 2-х минут. Нижний органический слой собирают, фильтруя через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 1 - 2 мл ацетона и дальнейшую очистку проводят на колонке с силикагелем (п. 2.6.2).

2.6.1.3. Масло подсолнечника. 20 г масла помещают в делительную воронку объемом 500 мл, добавляют 100 мл охлажденной смеси гексан:ацетон в соотношении 2:1 и осторожно круговыми движениями перемешивают в течение 2 - 3 минут. Затем добавляют 50 мл дистиллированной воды и встряхивают воронку в течение двух минут, происходит разделение слоев и перераспределение флутриафола в водно-ацетоновый слой, который собирают. К гексановому слою в делительной воронке добавляют 50 мл водного ацетона (50:50), интенсивно встряхивают и после полного разделения фаз собирают водно-ацетоновый слой. Промывку гексанового слоя повторяют. Собранный объединенный экстракт переносят в чистую делительную воронку и переэкстрагируют флутриафол хлористым метиленом трижды порциями по 50 мл. Органический слой фильтруют через безводный сульфат натрия и выпаривают досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 1 - 2 мл ацетона и дальнейшую очистку проводят на колонке с силикагелем (п. 2.6.2).

2.6.2. Очистка экстрактов на колонке с силикагелем

Растворенный в 1 - 2 мл ацетона сухой остаток пипеткой количественно переносят в хроматографическую колонку, колбочку ополаскивают еще 1 - 2 мл ацетона и вносят в колонку, после чего открывают кран и дают раствору впитаться в сорбент. Затем в колонку вносят 10 мл смеси гексан:ацетон в соотношении 2:3, элюат отбрасывают. Флутриафол элюируют 15 мл смеси гексан:ацетон в соотношении 1:5, элюат собирают и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона и хроматографируют.

2.6.3. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф "Цвет-550М" с ТИД или аналогичный. Колонка стеклянная 1 м х 3 мм, заполненная хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5% SE-30.

Температура колонки 230 °С, испарителя 240 °С, детектора 380 °С.

Скорость газа-носителя (азот) через колонку 30 куб. см/мин.

Расход водорода 16 куб. см/мин.

Расход воздуха 200 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы 1 мкл. Время удерживания флутриафола 2,28 мин.

2.6.4. Обработка результатов анализа

Содержание остаточных количеств флутриафола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор флутриафола 100 мкг/мл, разбавляют.

При проведении работы необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе в химических лабораториях, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и других используемых приборов.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

ВНИИ защиты растений.