"МУК 4.2.1773-03. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания"
(утв. Минздравом России 24.10.2003)

1. Разработаны Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).

2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.

3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Candida tropicalis Y-456 - продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".

На сусло-агаре на 2 - 3 сутки штамм образует круглые кремоватые колонии с ровным краем, средний диаметр изолированных колоний составляет 0,3 см, а максимальный - 0,8 см. В центре колоний образуется небольшое возвышение - "бугорок", на среде появляется маленькое желто-оранжевое окрашивание. Консистенция колоний мягкая, неплотная, вязкая. Поверхность гладкая, слегка матовая.

Морфологически штамм представлен полиморфными клетками: округлые, овальные, большей частью одиночные 2 - 4 мкм, иногда цепочки или конгломераты из вытянутых клеток 10 - 12 мкм. Наблюдается обилие бластоспор.

При выращивании на кукурузном агаре по Дальмау в чашках Петри обильно образуются псевдогифы с многократными разветвлениями и бластоконидиями, расположенными одиночно или цепочками вдоль гиф (8).

Систематическое положение микроорганизма

Штамм получен из ЦМПМ ВНИИгенетика как продуцент этанола и селектирован по признаку формирования крупных колоний на средах с ксилозой. Штамм является продуцентом ксилита. Продуктивность на средах с 5% содержанием ксилозы: максимальная - 80% ксилита, средняя - 78,8 - 76,2% (39,5 г/л) ксилита.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 35 - 37 °С, рН среды - 5,0 - 6,0. Для размножения используется сусло-агар 5 - 6 °Б, среда ДАП - глюкоза (ксилоза) - 20 г, дрожжевой экстракт - 2,0 г, пептон - 2 г, агар-агар - 20 г, вода - 1 л, рН среды - 5,0 - 6,0.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 30 кл./куб. м, пометка А.

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток дрожжевого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на аспирации из воздуха клеток дрожжеподобного гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчете выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2 сутки развития. В качестве дополнительного контроля предлагается отбор пробы на чашку Петри с селективной средой для дифференцирования С. tropicalis от других дрожжеподобных грибов, обладающих способностью к образованию ростковых трубок (9, 10).

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

Среда сусло-агар: солодовое сусло (значение Баллинга от 5 до 6 °) - 98%, агар-агар - 2%, рН среды 5,0 - 6,0, режим стерилизации: Р - 0,8 кгс/кв. см, 40 мин.

Спирт этиловый ректификат, ГОСТ 5962-67.

Сыворотка или плазма крови человека (вместо них можно использовать среду 199).

Антибиотик биомицин (хлортетрациклина гидрохлорид).

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования:

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5 °С), атмосферном давлении 30 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

Для определения концентрации клеток продуцента воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность среды сусло-агар. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 2 сутки после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам. Метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 37 °С. На 2-е сутки производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

Для постановки дополнительного контроля в среду добавляют сыворотку или плазму крови человека (можно также заменить средой 199) из расчета 0,5 мл сыворотки на 5 мл среды. После отбора проб инкубируют при 37 °С в течение 3 часов. При микроскопировании некоторые дрожжеподобные грибы (С. albicans) в отличие от С. tropicalis на селективной среде образуют ростковые трубки диаметром 3 - 4 мкм и длиной до 20 мкм (они сходны с мицелием, но не дают сужения в месте прикрепления к дрожжевой клетке).

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

где:

X - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

Результаты измерений оформляют протоколом по форме:

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96. М., 1991. 693 с.

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ "Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

5. ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.

6. Влодавец В.В., Немыря В.И. Санитарно-микологический контроль объектов окружающей среды на предприятиях микробиологической промышленности//Гиг. и сан., 1977. N 1. 25 - 28 с.

7. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. 122 с.

8. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно патогенных грибов. М.: Мир, 2001. 110 с.

9. Кашкин П.Н., Лисин В.В. Практическое руководство по медицинской микологии. М.: Медицина, 1983. 153 с.

10. Kwon-Chung K.J., Bennett J.E. Medical mycology. Philadelphia: Lea & Febiger, 1992. P. 61 - 62.