"МУК 4.1.1976-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств клопиралида в семенах, масле и соломке льна, в семенах и масле рапса методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 21.04.2005)

Действующее вещество: клопиралид.

Название по номенклатуре ИЮПАК: 3,6-дихлорпиридин-2-карбоновая кислота.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 192,0.

Химически чистое вещество: кристаллы белого цвета.

Температура плавления: 151 - 152 °С.

Растворимость (г/кг) при 20 °С: в воде - 1,0, циклогексаноне - 387, ацетоне - 153, ксилоле - 6,5.

В обычных условиях устойчив, с органическими и неорганическими основаниями образует хорошо растворимые в воде соли.

Краткая токсикологическая характеристика

Гигиенические нормативы

ВМДУ в семенах и масле рапса - 0,5 мг/кг.

Область применения

Гербицид для борьбы с некоторыми однолетними и многолетними двудольными сорными растениями.

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении остаточных количеств клопиралида из анализируемого объекта органическими растворителями, проведении очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и метилировании клопиралида диазометаном.

Количественное определение проводят методом внешнего стандарта с применением капиллярной газожидкостной хроматографии и использованием детектора электронного захвата (ДЭЗ).

2.1.2. Избирательность метода

Метод специфичен в присутствии других применяемых пестицидов. Проведение очистки экстрактов, а также использование капиллярной колонки и селективного детектора позволяет устранять влияние коэкстрактивных веществ на результаты анализа.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Диапазоны измеряемых концентраций, пределы обнаружения и другие метрологические параметры метода представлены в таблице.

2.4.1. Подготовка и очистка растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.4.2. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением в ацетоне 0,01 г клопиралида в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °С не более трех месяцев.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 1,6; 0,8; 0,4 и 0,2 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора клопиралида последовательным разбавлением ацетоном. Рабочие растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °С не более месяца.

В модельных опытах при изучении полноты извлечения используют аналогично приготовленные растворы клопиралида в гексане.

Для приготовления калибровочных растворов в мерные пробирки со шлифом емкостью 5,0 мл вносят по 1,0 мл рабочих растворов клопиралида с концентрациями 0,2; 0,4; 0,8 и 1,6 мкг/мл. Растворитель в пробирках упаривают в токе азота досуха и проводят метилирование клопиралида по п. 2.4.3.

2.4.3. Метилирование клопиралида

В пробирки с сухим остатком добавляют по 2,0 мл свежеприготовленного по п. 2.4.5 эфирного раствора диазометана. Пробирки закрывают пробками и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой 4 - 6 °С. После этого в пробирки добавляют по 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл.

2.4.4. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа (п. 2.7.3) вводят по 1 мкл приготовленных по п. 2.4.3 растворов, содержащих клопиралид (в виде производного) в концентрациях 0,2; 0,4; 0,8 и 1,6 мкг/мл. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм (кв. мм) от концентрации клопиралида в рабочем растворе в мкг/мл.

2.4.5. Приготовление эфирного раствора диазометана (из расчета метилирования экстрактов 2 проб)

N-нитрозометилмочевину массой 0,5 г помещают во флакон емкостью 2,0 - 3,0 мл и герметизируют резиновой пробкой и колпачком с помощью приспособления для обжима колпачков на флаконах. Этиловый эфир объемом 4,0 мл вносят в другой флакон емкостью 5,0 мл, герметизируют резиновой пробкой и колпачком и охлаждают в морозильной камере холодильника в течение 30 мин.

После этого флаконы через предварительно проколотые пробки соединяют гибкой тефлоновой трубкой (внутр. диам. ~ 1,5 - 2,0 мм), одним концом погружая ее в этиловый эфир на всю глубину (флакон с охлажденным этиловым эфиром обязательно должен еще иметь свободный выход в атмосферу). Во флакон с нитрозометилмочевиной, используя шприц с тонкой иглой и прокалывая пробку, добавляют по каплям по стенке 50% водный раствор гидроокиси калия (~ 0,3 мл) до прекращения реакции. Этиловый эфир при насыщении диазометаном окрашивается в ярко желтый цвет.

Внимание! Приготовление эфирного раствора диазометана и процедуру метилирования необходимо обязательно проводить в работающем вытяжном шкафу.

Отбор проб для анализа проводят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными 21.08.1979, N 2051-79.

Пробы семян просушивают до стандартной влажности и хранят при комнатной температуре в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.

Пробы соломки просушивают при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.

Пробы масла хранят в холодильнике при 4 - 6 °С в закрытой стеклянной таре.

Пробы семян перед анализом рассыпают на бумаге или кальке и пинцетом удаляют включения. Семена измельчают на лабораторной мельнице и после перемешивания измельченной массы отбирают усредненную аналитическую пробу.

Пробы соломки измельчают и после перемешивания измельченной массы отбирают усредненную аналитическую пробу.

2.7.1. Семена льна и рапса

2.7.1.1. Экстракция клопиралида и очистка экстракта

Аналитическую пробу семян массой 20 +/- 0,1 г помещают в плоскодонную колбу емкостью 300 мл, добавляют 150 мл смеси ацетон - дистиллированная вода (90:10), слегка встряхивают и подвергают обработке ультразвуком в УЗ-бане в течение 10 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон - дистиллированная вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

При использовании аппарата для встряхивания в плоскодонную колбу с аналитической пробой вносят 150 мл смеси ацетон - дистиллированная вода (90:10) и встряхивают в течение 60 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон - дистиллированная вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель до объема 10 - 20 мл при температуре 40 °С. В колбу-концентратор добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 2,0 мл 5,0%-го водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре 4 - 6 °С в течение 4 - 5 ч. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "белая лента" в делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 10% водный раствор гидроокиси калия до pH 9 - 10, 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 15-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 5-минутного отстаивания нижний водный слой сливают в химический стакан емкостью 500 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан - этиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний, гексано-эфирный, фильтруют через фильтр "синяя лента" со слоем безводного сульфата натрия (толщина ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан - этиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре 40 °С до объема 3 - 5 мл. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом емкостью 10 мл и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре 40 °С.

2.7.1.2. Метилирование клопиралида

В пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного по п. 2.4.5 эфирного раствора диазометана. Пробирку закрывают пробкой и ставят на 12 - 14 ч (на ночь) в холодильник с температурой 4 - 6 °С. После этого в пробирку добавляют 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл. Газохроматографический анализ на содержание клопиралида проводят по п. 2.7.4.

2.7.2. Масло льна и рапса

2.7.2.1. Экстракция клопиралида и очистка экстракта

Пробу масла массой 10,0 +/- 0,1 г растворяют в 50 мл н-гексана (насыщенного ацетонитрилом) в плоскодонной колбе емкостью 100 мл и после этого гексановый раствор масла переносят в делительную воронку емкостью 250 мл. Колбу промывают 50 мл ацетонитрила (насыщенного н-гексаном) и переносят его в воронку. Содержимое воронки встряхивают в течение 2 мин. После 5-минутного отстаивания нижний ацетонитрильный слой сливают в колбу-концентратор емкостью 100 мл. Колбу промывают еще 25 мл ацетонитрила (насыщенного н-гексаном) и также переносят в воронку (250 мл). Содержимое воронки встряхивают в течение 2 мин., отстаивают 5 мин. и нижний ацетонитрильный слой объединяют с предыдущим. Верхний гексановый слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным ацетонитрильным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель досуха при температуре 50 °С. Сухой остаток растворяют в 20 мл ацетона. К раствору добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 2,0 мл 5,0%-го водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре 4 - 6 °С в течение 4 - 5 ч. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "белая лента" в делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 10%-й водный раствор гидроокиси калия до pH 9 - 10, 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 15-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 5-минутного отстаивания нижний водный слой сливают в химический стакан емкостью 500 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан - этиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний, гексано-эфирный, фильтруют через фильтр "синяя лента" со слоем безводного сульфата натрия (толщина ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан - этиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре 40 °С до объема 3 - 5 мл. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом емкостью 10 мл и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре 40 °С.

2.7.2.2. Метилирование клопиралида

В пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного по п. 2.4.5 эфирного раствора диазометана. Пробирку закрывают пробкой и ставят на 12 - 14 ч (на ночь) в холодильник с температурой 4 - 6 °С. После этого в пробирку добавляют 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл. Газохроматографический анализ на содержание клопиралида проводят по п. 2.7.4.

2.7.3. Соломка льна

2.7.3.1. Экстракция клопиралида и очистка экстракта

Аналитическую пробу соломки массой 5,0 +/- 0,1 г помещают в плоскодонную колбу емкостью 300 мл, добавляют 150 мл смеси ацетон - дистиллированная вода (80:20), слегка встряхивают и подвергают обработке ультразвуком в УЗ-бане в течение 10 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон - дистиллированная вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

При использовании аппарата для встряхивания в плоскодонную колбу с аналитической пробой вносят 150 мл смеси ацетон - дистиллированная вода (80:20) и встряхивают в течение 60 мин. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл смеси ацетон - дистиллированная вода (90:10), которую также фильтруют в колбу-концентратор.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель до объема 10 - 20 мл при температуре 40 °С. В колбу-концентратор добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 2,0 мл 5,0%-го водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре 4 - 6 °С в течение 4 - 5 ч. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр "белая лента" в делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 10%-й водный раствор гидроокиси калия до pH 9 - 10, 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 15-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 мл н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2 мин. После 5-минутного отстаивания нижний водный слой сливают в химический стакан емкостью 500 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан - этиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний, гексано-эфирный, фильтруют через фильтр "синяя лента" со слоем безводного сульфата натрия (толщина ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан - этиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре 40 °С до объема 3 - 5 мл. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом емкостью 10 мл и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре 40 °С.

2.7.3.2. Метилирование клопиралида

В пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного по п. 2.4.5 эфирного раствора диазометана. Пробирку закрывают пробкой и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой 4 - 6 °С. После этого в пробирку добавляют 1,0 мл изооктана и упаривают растворители в токе азота до 1,0 мл. Газохроматографический анализ на содержание клопиралида проводят по п. 2.7.4.

2.7.4. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф с ДЭЗ.

Колонка хроматографическая кварцевая капиллярная длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой ВР-50 (OV-17, HP-17, DB-17), толщина слоя - 0,5 мкм.

Температура колонки: программирование от 100 °С (3 мин.) до 280 °С (25 мин.) со скоростью 8,0 °С/мин.

Температура испарителя: 240 °С.

Температура детектора: 300 °С.

Расход газов: газа-носителя (азот вч) - 1,5 куб. см/мин., дополнительного газа (азот вч) к ДЭЗ - 40 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы: 1 мкл.

Время удерживания клопиралида (в виде производного): 14,20 +/- 0,05 мин.

Предел детектирования: 0,1 нг.

Линейный диапазон детектирования: 0,2 - 2,0 нг.

2.7.5. Обработка результатов анализа

Необходимо соблюдать общепринятые правила техники безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами, а также требования, изложенные в документации к приборам.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

П.А. Тарарин, Т.А. Маханькова, Л.В. Григорьева (ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург).