"МУК 4.1.1998-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств диквата в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 22.07.2005)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана; Всероссийским институтом защиты растений при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 16.06.2005).

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирмы-регистранты: Август, АгроЭкспертГруп, Агрусхим.

Торговое наименование: Суховей, Голден ринг, Дикватерр.

Действующее вещество: дикват.

Структурная формула (не приводится).

1,1'-этилен-2,2'-дипиридилдиилиум дибромид.

Мол. масса: 344,1.

Дикват дикатион: 9,10-дигидро-8а, 10а-диазониафенантрен; 6,7-дигидродипиридо-[1,2-альфа:2',1'-с]пиразин-5,8-ди-иум (IUPAC); 6,7-дигидродипиридо-[1,2-альфа:2',1'-с]пиразиндииум (С.А.).

Мол. масса: 184,2.

Дикват дибромид - кристаллы от белых до желтых. Температура плавления: 325 °С (моногидрат).

Гигиенические нормативы для диквата в России:

МДУ для гороха - 0,05 мг/кг; МДУ для семян подсолнечника - 0,5 мг/кг; МДУ для масла подсолнечника - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата: дикват - неселективный контактный гербицид и десикант. Используется для предурожайного осушения хлопка, люцерны, клевера, люпина, подсолнечника, бобовых, зерновых и др. культур.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении диквата методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на патронах Диапак С-16.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

Ацетонитрил для ВЭЖХ "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бикарбонат натрия, х.ч., ГОСТ 4201-79.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Дикват дибромид моногидрат, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,2% (Sigma-Aldrich).

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная, имп. (Ferak, Германия) или х.ч., ГОСТ 6552-80.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ (п. 2.5.3).

Соляная кислота, конц., ГОСТ 857-88.

Соляная кислота, 0,1 М водный раствор.

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Этиловый спирт, о.с.ч., ТУ 6-09-4512-77.

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки, или другой с аналогичными техническими характеристиками.

Колонка Symmetry-С18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA), или аналогичная.

Предколонка Waters Symmetry С-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ100 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ100 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Патроны Диапак С-16.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличных. Правила приемки и методы отбора проб".

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 мл растворителя испаряют при помощи вакуумного ротационного испарителя при температуре 40 °С до объема 1 мл и хроматографируют. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют. Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием. Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку Symmetry-С18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,8 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

Внимание! После каждых 5 - 10 вводов в хроматограф анализируемых экстрактов необходимо промывать колонку раствором ацетонитрил:вода (30:70 по объему) в течение 5 - 10 мин. со скоростью 3 мл/мин. для предотвращения сдвигов пиков коэкстрактивных веществ, которые могут мешать определению диквата.

2.5.3. Приготовление растворов

Для получения 50%-ного водного этанола в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл этанола с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления подвижной фазы в колбе на 1000 мл смешивают 50 мл ацетонитрила и 950 мл раствора N 1, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют.

2.5.4. Приготовление градуировочных растворов

Берут точную навеску диквата дибромида (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в бидистиллированной воде и доводят до метки (исходный раствор с концентрацией 0,5 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы - ацетонитрил:раствор N 1 (5:95 по объему).

Растворы для внесения в семена при определении полноты извлечения диквата с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из исходного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом. Образец для внесения помещается во фторопластовый стакан, после внесения пробу выдерживают в течение часа при комнатной температуре.

Внесение в масло проводят следующим образом: 20 мг аналитического стандарта вносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют его в 10 мл изопропилового спирта, доводят до метки подсолнечным маслом и хорошо перемешивают. Затем колбу нагревают на водяной бане для удаления растворителя и отстаивают до получения однородного прозрачного раствора. Этот раствор разбавляют подсолнечным маслом до получения требуемой концентрации диквата в масле.

Исходный раствор аналитического стандарта можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в полиэтиленовом флаконе в течение 1 месяца, градуировочные растворы готовят перед проведением градуировки прибора.

2.5.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация диквата в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации диквата в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6. Подготовка патрона Диапак С-16 для очистки экстракта

Концентрирующий патрон Диапак С-16 промывают последовательно с помощью шприца 20 мл смеси этанол - вода (50:50) и 20 мл этанола со скоростью 5 мл/мин. После чего он готов к работе.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения диквата на патроне Диапак С-16

В мерную колбу емкостью 100 мл отбирают 0,4 мл раствора диквата дибромида с концентрацией 0,5 мг/мл и доводят объем до метки этанолом. К 1 мл полученного раствора добавляют еще 4 мл этанола и наносят на приготовленный по п. 2.5.6 патрон. Как только уровень жидкости достигнет верхнего края патрона, его промывают еще 50 мл этанола. (Нельзя допускать высыхания твердой фазы в патроне.) Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание диквата по п. 2.6.5. Суммируя результаты, рассчитывают содержание диквата в элюате, определяя полноту вымывания вещества из патрона и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: профиль вымывания диквата может меняться при использовании новой партии патронов Диапак С-16.

2.5.8. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6.1. Экстракция диквата из семян подсолнечника

Навеску массой 20 г измельченных на лабораторной зерновой мельнице семян подсолнечника помещают в коническую колбу емкостью 100 мл и экстрагируют дикват 50 мл смеси этанол - 0,1 М HCl (80:20 по объему) на ультразвуковой установке в течение 15 мин. (или нагревают в круглодонной колбе с обратным холодильником в течение 50 мин. при 100 °С). Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт упаривают на роторном испарителе до водного остатка при температуре не выше 50 °С, нейтрализуют 0,1 М раствором бикарбоната натрия до pH 7. Объем экстракта доводят до 50 мл дистиллированной водой. Дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.3.

2.6.2. Экстракция диквата из масла подсолнечника

Навеску масла массой 20 г растворяют в 100 мл гексана. Раствор фильтруют через фильтр "красная лента", помещают в делительную воронку емкостью 250 мл и переэкстрагируют дикват дистиллированной водой трижды порциями по 20 мл, встряхивая воронку каждый раз в течение 2 - 3 мин.<*> Дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.3.

--------------------------------

<*> В случае образования стойких эмульсий на стадии переэкстракции диквата из гексана для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта.

2.6.3. Очистка экстрактов

Полученные по п. п. 2.6.1 и 2.6.2 экстракты помещают в делительную воронку на 250 мл и промывают дважды этилацетатом и дважды гексаном порциями по 25 мл, встряхивая воронку в течение 2 - 3 минут (при всех промывках верхний органический слой отбрасывают). Водный раствор упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 50 °С. Сухой остаток растворяют в 50 мл этанола, выдерживая колбу в ультразвуковой ванне в течение 5 мин. Раствор фильтруют через фильтр "красная лента" и упаривают на роторном испарителе до объема ~ 5 мл при температуре не выше 50 °С и сразу же проводят дальнейшую очистку экстракта по пункту 2.6.4.

2.6.4. Очистка экстрактов на патроне Диапак С-16

Полученный по п. 2.6.2 раствор количественно переносят в подготовленный по п. 2.5.6 патрон Диапак С-16. Колбу обмывают еще 5 мл этанола и также переносят на патрон. (Не допускать пересыхания патрона!) Патрон промывают 40 мл этанола. Элюат собирают, упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 50 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Рабочая длина волны: 310 нм.

Колонка Symmetry С-18 (250 x 4,6) мм, 5 мкм (Waters).

Предколонка Waters Symmetry С-18. Температура колонки 30 +/- 1 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - раствор N 1 в соотношении 5:95 (по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 мл/мин. Объем вводимой пробы 50 мкл.

Время удерживания диквата: 5,05 +/- 0,05 мин.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 2,0 мкг/мл.

2.6.4. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание диквата (в пересчете на дикатион) в образце воды, почвы или растений (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств диквата в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор диквата 2 мкг/мл, разбавляют.

При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88). При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".