"МУК 4.1.1899-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Атомно-абсорбционное измерение массовых концентраций селена в эритроцитах и плазме крови. Методические указания"
(утв. Минздравом России 03.03.2004)

1. Разработаны: к.х.н. И.Л. Гринштейн, Л.А. Васильева, Л.П. Полякова (РНЦ "Прикладная химия"), к.х.н. В.П. Ипполитова, к.б.н. Е.А. Комракова (Нижегородский НИИ гигиены и профпатологии).

2. Подготовлены творческим коллективом специалистов в составе: Л.М. Безрукавникова, Л.Г. Макеева, Г.В. Муравьева.

3. Рекомендованы к утверждению на совместном заседании группы Главного эксперта Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию по проблеме "Лабораторно-инструментальное дело и метрологическое обеспечение" и методбюро п/секции "Промышленно-санитарная химия" Проблемной комиссии "Научные основы медицины труда".

4. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Министерстве здравоохранения Российской Федерации.

5. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 3 марта 2004 г.

6. Введены в действие с 1 мая 2004 г.

Методические указания по определению массовых концентраций химических веществ в биологических средах предназначены для использования в системе Госсанэпиднадзора России, в лечебных и научных учреждениях, работающих в области медицины труда, промышленной экологии и экологии окружающей среды.

Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием металлов и химических соединений в крови и моче людей, подвергающихся неблагоприятному воздействию вредных производственных и экологических факторов.

В сборнике представлены 5 методик по измерению концентраций 6 металлов и 3 химических соединений в моче и крови. Методики основаны на использовании атомно-абсорбционных и газохроматографических методов анализа.

Включенные в сборник Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система единства измерений. Методики выполнения измерений", МИ 2336-95 "Характеристики погрешности и результатов количественного химического анализа. Алгоритмы оценивания", МИ 2336-96 "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Методические указания устанавливают количественный атомно-абсорбционный анализ плазмы (сыворотки) и эритроцитов крови на содержание селена в диапазоне концентраций 0,001 - 0,02 мкг/куб. см.

Молекулярная масса - 78,96.

Регистрационный номер CAS: 7782-49-2.

Селен обладает двойственными свойствами, с одной стороны необходим для жизни, с другой - является токсичным элементом. Селен выполняет роль катализатора ряда ферментативных реакций, участвует в реакции окислительно-восстановительных процессов, является стабилизатором плазматических ядерных и внутриклеточных мембран, обладает антиокислительными свойствами и в некоторых биохимических реакциях заменяет витамин Е.

Механизм токсического действия селена связан с замещением серы в биохимически активных веществах в процессе метаболизма, селен входит в активный центр глютатионпероксидазы. По характеру действия соединения селена несколько напоминают соединения мышьяка, обладают политропным действием. В ряде случаев его воздействие вызывает изменение ткани зубов, заболевания ногтей, желудочно-кишечные нарушения, нервные расстройства. Химическая форма селена может изменяться после контакта с влажными слизистыми оболочками, с потом. Соединения селена более токсичны, чем элементарный селен. Диапазон физиологически оптимальных концентраций селена узок, при уровне ниже минимального предела отмечается увеличение риска возникновения и развития кардиологических и ряда онкологических заболеваний, ослабление антиоксидантной защиты организма. Изменения содержания селена происходят раньше в плазме (сыворотке), чем в эритроцитах.

Нормальной концентрацией селена в плазме (сыворотке) крови считается диапазон от 0,053 до 0,105 мкг/куб. см.

Методика обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации селена с погрешностью, не превышающей +/- 28%, при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на минерализации проб плазмы и эритроцитов крови концентрированной азотной кислотой и пероксидом водорода, получении летучего гидрида селена, его термическом разложении и последующем измерении резонансного поглощения линии селена на атомно-абсорбционном спектрометре.

Нижний предел измерения концентрации селена в минерализате 0,001 мкг/куб. см.

5.1.1. Атомно-абсорбционный спектрометр КВАНТ-2А, ГКНЖ 30.00.000, ТУ 4434-030-29903757-99, оснащенный гидридной приставкой ГРГ-107, ГКНЖ 46.00.000 ТУ 4434-030-29903757-99 и источником излучения для определения селена (лампой полого катода).

5.1.2. Весы лабораторные ВЛР-200, ГОСТ 24104-88Е.

5.1.3. Колбы мерные 2-25-2; 2-50-2; 2-100-2; 2-200-2; 2-250-2, ГОСТ 1770-74Е.

5.1.4. Пипетки мерные 4(5)-1-1; 4(5)-1-2; 4(5)-1-5; 4(5)-1-10; 4(5)-1-20, ГОСТ 29227-91.

5.1.5. Пробирки мерные, вместимостью 10 куб. см, ГОСТ 25336-82Е.

5.1.6. Стаканы Н-1-10 ТХС, Н-1-25; Н-1-100, ГОСТ 25336-82Е.

5.1.7. Колба коническая, вместимостью 100 куб. см, ГОСТ 25366-82Е.

5.1.8. Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; пределы 0 - 200 °С, цена деления 0,1 °С, ГОСТ 215-73Е.

5.1.9. Электроплитка бытовая, ГОСТ 14919-83.

5.1.10. Аналитический реактор для минерализации проб РМП-25, изготовленный НПО "Метрология" г. Казань (аналитический автоклав), МУК 4.1.985-00.

5.1.11. Термостат с автоматической регулировкой температуры до 200 °С.

5.1.12. Ацетилен технический, в баллонах, ГОСТ 5457-75.

5.1.13. Аргон газообразный в баллонах, ТУ 21-12-79.

5.1.14. Часовое стекло.

5.1.15. Центрифуга лабораторная клиническая Опн-3, ТУ 5375-4260-76.

5.2.1. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72 или бидистиллированная.

5.2.2. Натрия гидроксид, ГОСТ 4328-77.

5.2.3. Боргидрид натрия (тетрагидроборат натрия), ТУ 1-92-162-90.

5.2.4. Пероксид водорода о.с.ч., ГОСТ 10929-76.

5.2.5. Стандартный образец состава раствора ионов селена с массовой концентрацией селена 1,0 мг/куб. см; ГСО 7779-2000.

5.2.6. Кислота азотная о.с.ч., ГОСТ 11125-73.

5.2.7. Кислота соляная о.с.ч., ГОСТ 14261-77.

5.2.8. Гепарин для инъекций, N сертификата соответствия 50-20-70546 от 29.07.02.

5.2.9. Натрия хлорид, ГОСТ 4233-77.

5.2.10. Мочевина, ГОСТ 6691.

Допускается использование других средств измерений, вспомогательного оборудования, материалов и реактивов с техническими и метрологическими характеристиками и квалификацией не хуже приведенных в разделе.

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При выполнении измерений с использованием атомно-абсорбционного спектрометра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением, необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" (ПБ-10-115-96), утвержденные Постановлением Госгортехнадзора России 18.04.95 N 20 и ГОСТ 12.2.085.

6.4. Реакционный блок ГРГ-107 предохраняют от ударов и резких толчков, не допускают перекосов сосудов в генераторе.

Неиспользованные растворы боргидрида натрия перед утилизацией дезактивируют в вытяжном шкафу избыточным объемом 10%-ного раствора азотной кислоты в толстостенном сосуде объемом 500 куб. см.

К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим или среднеспециальным образованием, имеющих опыт работы в химической лаборатории, овладевших персональным компьютером и программным обеспечением на уровне пользователя, техникой эксплуатации пламенно-абсорбционного спектрометра типа "Квант", генератора ртутно-гидридного ГРГ-107.

8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 84 - 106 кПа и относительной влажности воздуха не более 80%.

Кровь берут из вены в количестве 5 куб. см. В пробирку с кровью вносят 0,1 куб. см гепарина, перемешивают, центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин. Отделяют плазму от эритроцитов. Эритроциты отмывают дважды физиологическим раствором.

Плазму и эритроциты минерализуют отдельно в аналитических автоклавах по следующей схеме: 1 куб. см плазмы и эритроцитов помещают в тефлоновые стаканчики автоклава, добавляют по 1,5 см концентрированной азотной кислоты, через 15 - 20 мин. добавляют 1 куб. см 36%-ного пероксида водорода, закрывают крышкой, герметизируют в металлическом корпусе. Автоклав помещают в термостат, выдерживают при T 190 °С 60 мин., вынимают, охлаждают. В тефлоновый стаканчик добавляют 1,5 куб. см концентрированной соляной кислоты и нагревают при температуре 95 °С в течение 30 мин., охлаждают и добавляют 0,2 куб. см 10%-ного раствора мочевины. Для получения "холостой" пробы в тефлоновый стакан помещают 1 куб. см бидистиллированной воды, 1 каплю гепарина, 1,5 куб. см азотной кислоты, 1 куб. см 36%-ного пероксида водорода и поступают как описано выше. Объем полученного минерализата плазмы, эритроцитов, холостой пробы доводят 6 М раствором соляной кислоты до 10 куб. см. Пробы готовы к измерению. При невозможности немедленного анализа минерализаты хранят в холодильнике. Срок хранения 1 месяц.

9.2.1. Раствор соляной кислоты молярной концентрации 6 моль/куб. дм.

486 куб. см соляной кислоты d = 1,19 г/куб. см помещают в мерную колбу, вместимостью 1 куб. дм, доводят объем до метки дистиллированной водой.

9.2.2. Стандартный раствор N 1 с массовой концентрацией селена 50 мкг/куб. см. Готовят из стандартного раствора ионов селена с массовой концентрацией 1,0 мг/куб. см. Вскрывают ампулу, содержимое выливают в сухую пробирку, отмеряют пипеткой 5 куб. см, переносят его в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 3 месяца.

9.2.3. Стандартный раствор N 2 с массовой концентрацией 0,5 мкг/куб. см. Готовят из раствора N 1. Отбирают 1 куб. см в коническую колбу, вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см 6 М раствора соляной кислоты, нагревают на плитке в течение 20 - 30 минут, не допуская сильного кипения, переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 100 куб. см. Коническую колбу из-под раствора несколько раз промывают 6 М раствором соляной кислоты, сливая в мерную колбу. Полученный раствор доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 месяц.

9.2.4. Стандартный раствор N 3 с массовой концентрацией селена 0,020 мкг/куб. см. Готовят из раствора N 2. Пипеткой переносят 4 куб. см в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 день.

9.2.5. Стандартный раствор N 4 с массовой концентрацией селена 0,010 мкг/куб. см. Готовят из раствора N 2. Отбирают пипеткой 2 куб. см в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 день.

9.2.6. Стандартный раствор N 5 с массовой концентрацией 0,005 мкг/куб. см. Готовят из раствора N 2. 1 куб. см раствора селена с концентрацией 0,5 мкг/куб. см переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 день.

9.2.7. Стандартный раствор N 6 с массовой концентрацией селена 0,002 мкг/куб. см. Готовят из раствора N 3 с массовой концентрацией селена 0,020 мкг/куб. см. Отбирают пипеткой 10 куб. см в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, доводят 6 М раствором соляной кислоты до метки.

9.2.8. Стандартный раствор N 7 с массовой концентрацией 0,001 мкг/куб. см. Готовят из раствора N 4 с массовой концентрацией селена 0,010 мкг/куб. см. Отбирают 10 куб. см в мерную колбу на 100 куб. см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты.

9.2.9. Раствор гидроксида натрия с массовой долей - 1%. Готовят растворением 1 г гидроксида натрия в 99 куб. см бидистиллированной воды.

9.2.10. Раствор боргидрида натрия с массовой долей 1,5%. 1,5 г боргидрида натрия растворяют в 98,5 99 куб. см 1%-ного раствора гидроксида натрия. Раствор выдерживают не менее одного часа под часовым стеклом, переливают в полиэтиленовую банку с крышкой. Срок хранения 1 - 2 недели.

9.2.11. Раствор натрия хлорида с массовой концентрацией 0,9% (физиологический раствор). Готовят растворением 0,9 г натрия хлорида в 99,1 99 куб. см бидистиллированной воды.

Установить при выключенном приборе спектральную лампу на селен.

Открыть вентиль воздушной магистрали.

Открыть вентиль на баллоне с горючим газом.

Установить с помощью редукторов, необходимое давление для ацетилена 0,12 - 0,18 Мпа (1,2 - 1,8 атм.); для аргона и воздуха 3 - 4 атм.

Подготовить к работе ртутно-гидридную приставку в соответствии с руководством по эксплуатации ГКНЖ 46.00.000 РЭ, генератор ртутно-гидридный ГРГ-107.

Включить компьютер и произвести запуск компьютерной программы.

Включить кнопку "Сеть" и нажать кнопку "Сброс" на передней панели спектрометра.

С помощью компьютерной программы загрузить выбранную методику на селен. Программа автоматически установит значения параметров прибора (токов спектральных ламп, напряжение питания ФЭУ).

После выхода в графический экран добиться максимального значения интенсивности в канале лампы полого катода селена (за счет уточнения длины волны, юстировки спектральных ламп).

Оставаясь в графическом экране, произвести, в случае необходимости, корректировку считанных из методики значений токов спектральных ламп и напряжения питания ФЭУ.

После корректировки значения сигналов в каналах лампы полого катода и дейтеревой лампы должны быть близки к 100.

Подать команду на зажигание пламени "поджечь".

Промыть горелку, при горящем пламени опустить капилляр в промывочный раствор (6 М раствор соляной кислоты) на 1 мин.

Рабочие параметры, устанавливаемые на спектрометре и условия определения селена для ртутно-гидридного генератора, диапазон определяемых концентраций представлены в табл. 1.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины абсорбции от массовой концентрации селена (мкг/куб. см) устанавливают путем измерения величины абсорбции стандартных растворов, приготовленных согласно табл. 2.

Замеряют величину абсорбции указанных градуировочных растворов и холостой пробы по алгоритму программы спектрометра.

В реакционный сосуд "Р" помещают с помощью пипетки 10 куб. см градуировочного раствора или холостой пробы, устанавливают сосуд в реакционный блок, проводят измерение.

Проводят по пять параллельных измерений со всеми пятью указанными градуировочными растворами.

Программа компьютера строит по средним значениям результатов измерений абсорбции градуировочный график.

Перед каждым началом работы, а также в процессе работы через 10 - 15 измерений уточняют вызванную из памяти компьютера градуировку по одному или двум растворам.

При проведении измерений концентраций селена в пробах выполняют следующие операции:

- Заполняют сосуд для раствора реагента - раствором боргидрида натрия, объемом не более 40 куб. см.

- В реакционный сосуд вносят дозированный объем подготовленной пробы (10 куб. см).

- Оба сосуда устанавливают в соответствующий блок генератора "ГРГ-107".

- Подают с помощью компьютера команду "измерение".

- Выполняют измерения "холостой" пробы.

При замерах концентраций селена в пробах свыше 0,02 мкг/куб. см пробы разбавляют.

Результат количественного анализа представляют в виде C +/- ДЕЛЬТА мкг/куб. см, P = 0,90, ДЕЛЬТА = 0,283 х C.

Образцами для контроля могут быть пробы плазмы и эритроцитов крови.

Объем отобранной для контроля пробы должен соответствовать удвоенному объему, необходимому для проведения анализа по методике. Минерализат, полученный после обработки пробы делят на две равные части и анализируют в точном соответствии с прописью методики, варьируя условия проведения анализа, т.е. получают два результата в разных лабораториях или в одной, используя при этом разные наборы мерной посуды, разные партии реактивов. Два результата анализа не должны отличаться друг от друга на величину допускаемых расхождений между результатами анализа.

сигма (ДЕЛЬТА) - показатель воспроизводимости (характеристика случайной составляющей погрешности, соответствующая содержанию компонента в пробе).

При превышении норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива Д выявляют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля и устраняют их.

x - величина добавки анализируемого компонента;

K - норматив оперативного контроля погрешности.

Для проведения анализа одной пробы на содержание селена требуется 4 ч.