"МУК 4.1.2021-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств хизалофоп-П-этила и пропаквизафопа в семенах и масле рапса и пропаквизафопа в кочанах капусты по основному метаболиту хизалофоп-П кислоте методом капиллярной газожидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 17.10.2005)

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1.1. Краткая характеристика препаратов

1.1.1. Краткая характеристика препаратов Леопард, КЭ.

Фирма-производитель: "Аган Кемикал Мэньюфекчерэз Лимитед Лтд".

Действующее вещество (д.в.): хизалофоп-П-этил.

Название д.в. по номенклатуре ИЮПАК: (R)-2-[4-[(6-хлорхиноксалин-2-илокси)-фенокси]пропионовой кислоты этиловый эфир.

Структурная формула д.в.: (не приводится).

Молекулярная масса д.в.: 372,8.

Химически чистое вещество: светло-коричневые кристаллы.

Температура плавления д.в.: 76 - 77 °С.

Давление пара д.в. при 20 °С: 0,011 мПа.

Растворимость д.в. (г/л) при 20 °С: в воде - 0,0004, в гексане - 5,0, этаноле - 22, ксилоле - 360, ацетоне - 650.

Стабильность д.в.: устойчив к действию света, разлагается до хизалофоп-П кислоты под действием разбавленных кислот и щелочей.

Гигиенические нормативы: МДУ для рапса в России не установлен.

1.1.2. Краткая характеристика препарата Шогун, КЭ.

Фирма-производитель: "Аган Кемикал Мэньюфекчерэз Лимитед Лтд".

Действующее вещество (д.в.): пропаквизафоп.

Название д.в. по номенклатуре ИЮПАК: (R)-2-[4-[(6-хлорхиноксалин-2-илокси)-фенокси]пропионовой кислоты 2-изопропилиденаминооксиэтиловый эфир.

Структурная формула д.в.: (не приводится).

Молекулярная масса д.в.: 344,8.

2.1.1. Принцип метода.

Метод основан на количественном определении хизалофоп-П кислоты, основного метаболита хизалофоп-П-этила и пропаквизафопа, и включает извлечение остаточных количеств хизалофоп-П кислоты из анализируемого объекта органическими растворителями, очистку экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и метилирование хизалофоп-П кислоты диазометаном. Количественное определение проводят методом внешнего стандарта с применением капиллярной газожидкостной хроматографии и использованием термоионного детектора (ТИД).

2.1.2. Избирательность метода.

Метод специфичен в присутствии других применяемых в сельском хозяйстве пестицидов. Способы очистки экстрактов, а также применение селективного детектора и капиллярной колонки позволяет устранять влияние коэкстрактивных веществ на результаты анализа.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода.

Диапазоны измеряемых концентраций, пределы обнаружения и другие метрологические параметры метода представлены в таблицах 1 и 2.

Аналитический стандарт хизалофоп-П кислоты.

Азот газообразный высокой чистоты, ТУ 301-07-25-89.

Ацетон, осч, ТУ 2633-004-11291058-94.

Ацетонитрил для хроматографии, хч, ТУ 6-09-4326-76.

Вата медицинская, ТУ 9393-001-00302238-97.

н-Гексан, хч, ТУ 6-09-3375-78.

Дихлорметан, хч, ТУ 6-09-2662-77.

Изооктан эталонный, ГОСТ 12433-83.

Калия гидроокись, чда, ГОСТ 24363-80.

Натрий сернокислый б/в (сульфат), чда, ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, чда, ГОСТ 4233-77.

N-Нитрозометилмочевина, хч, ТУ 6-09-11-1643-82.

Серная кислота, осч, ГОСТ 14262-78.

Спирт этиловый ректификат (этанол), ГОСТ 17299-78.

Фильтры бумажные красная лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные белая лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные синяя лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Эфир этиловый (серный), ОСТ 84-2006-88.

Хроматограф газовый с ТИД.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая длиной 15 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой SE-52, толщина слоя - 0,45 мкм.

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73, или аналогичный.

Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 34104-80.

Весы лабораторные типа ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-80.

Воронки делительные емкостью 250 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Индикаторная бумага универсальная, ТУ 6-09-1181-76.

Колбы-концентраторы емкостью 100 и 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы плоскодонные емкостью 100 и 300 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные со шлифом емкостью 25, 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Колпачки алюминиевые для герметизации флаконов, ГОСТ Р 51314-99.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79, или аналогичная.

Микрошприц МШ-10, ТУ 2-833-106.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Ротационный вакуумный испаритель типа ИР-1 или аналогичный.

Пипетки мерные емкостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74.

Приспособление для обжима колпачков на флаконах, ТУ 42-2-2442-73.

Пробирки мерные со шлифом емкостью 5,0 мл, ГОСТ 1770-74.

Стаканы химические на 100, 200 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Установка для перегонки растворителей при атмосферном давлении.

Установка для упаривания растворителей в токе азота.

Установка ультразвуковая "Серьга" УЗМ002 или аналогичная.

Флаконы стеклянные (типа пенициллиновых) емкостью 5,0 мл, ТУ 64-2-10-87.

Электроплитка, ГОСТ 14919-83.

2.4.1. Подготовка и очистка растворителей.

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °С до объема 1,0 мл и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.4.2. Приготовление стандартных растворов.

Основной раствор хизалофоп-П кислоты с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением в смеси ацетон:этанол (80:20) 0,01 г аналитического стандарта в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре +4 - 6 °С не более трех месяцев.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 4,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора хизалофоп-П кислоты соответствующим последовательным разбавлением ацетоном.

Для приготовления калибровочных растворов в мерные пробирки со шлифом емкостью 5,0 мл вносят по 1,0 мл рабочих растворов хизалофоп-П кислоты с концентрациями 0,5; 1,0; 2,0 и 4,0 мкг/мл. Растворители в пробирках упаривают в токе азота досуха и проводят метилирование хизалофоп-П кислоты.

В пробирки добавляют по 2,0 мл свежеприготовленного эфирного раствора диазометана (п. 2.4.4), закрывают притертыми пробками и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4 - 6 °С. После этого этиловый эфир в пробирках упаривают досуха в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 1,0 мл изооктана и хроматографируют по п. 2.6.3.

2.4.3. Построение калибровочного графика.

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл приготовленных по п. 2.4.2 растворов, содержащих хизалофоп-П кислоту (в виде хизалофоп-П-метила) в концентрациях 0,5; 1,0; 2,0 и 4,0 мкг/мл. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм (кв. мм) от концентрации хизалофоп-П кислоты в рабочем растворе в мкг/мл.

2.4.4. Приготовление эфирного раствора диазометана (из расчета метилирования хизалофоп-П кислоты в экстрактах 2-х проб).

N-Нитрозометилмочевину массой 0,5 г помещают во флакон емкостью 2,0 - 3,0 мл и герметизируют резиновой пробкой и колпачком с помощью приспособления для обжима колпачков на флаконах. Этиловый эфир объемом 4,0 мл вносят в другой флакон емкостью 5,0 мл, герметизируют резиновой пробкой и колпачком и охлаждают в морозильной камере холодильника в течение 30 минут.

После этого флаконы через предварительно проколотые пробки соединяют гибкой тефлоновой трубкой (внутр. диам. ~ 1,5 - 2,0 мм), одним концом погружая ее в этиловый эфир на всю глубину (флакон с охлажденным этиловым эфиром обязательно должен еще иметь свободный выход в атмосферу). Во флакон с нитрозометилмочевиной, используя шприц с тонкой иглой и прокалывая пробку, добавляют по каплям по стенке 50%-ный водный раствор гидроокиси калия (~ 0,3 мл) до прекращения реакции. Этиловый эфир при насыщении диазометаном окрашивается в ярко-желтый цвет.

Внимание! Приготовление эфирного раствора диазометана и процедуру метилирования необходимо обязательно проводить в работающем вытяжном шкафу.

Отбор проб рапса для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", отбор проб капусты проводят в соответствии с ГОСТ 1724-85 "Капуста белокочанная свежая. Заготовка и поставка" или ГОСТ 7967-87 "Капуста краснокочанная свежая. Заготовка и поставка".

Для длительного хранения аналитические пробы кочанов капусты помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре.

Пробы семян рапса просушивают до стандартной влажности и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре. Перед анализом пробы семян рапса рассыпают на бумаге или кальке и пинцетом удаляют включения. Семена измельчают на лабораторной мельнице и после перемешивания измельченной массы отбирают усредненную аналитическую пробу.

Пробы масла рапса хранят при +4 - 6 °С в закрытой стеклянной таре.

2.6.1. Кочаны капусты и семена рапса.

2.6.1.1. Экстрагирование и очистка экстракта.

Аналитическую пробу массой 25,0 +/- 0,1 г помещают в плоскодонную колбу емкостью 300 мл и добавляют к пробе кочанов капусты 150 мл смеси ацетон:этанол (80:20), а к пробе семян рапса 150 мл смеси ацетон:этанол:бидистиллированная вода (70:20:10). Содержимое колбы слегка встряхивают и подвергают обработке ультразвуком в УЗ-бане в течение 10 минут. После этого экстракт фильтруют через бумажный фильтр белая лента в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл ацетона, который также фильтруют в колбу-концентратор.

При использовании аппарата для встряхивания в колбу с аналитической пробой кочанов капусты вносят 150 мл смеси ацетон:этанол (80:20), а к пробе семян рапса добавляют 150 мл смеси ацетон:этанол:бидистиллированная вода (70:20:10). Содержимое колбы встряхивают в течение 60 минут. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр белая лента в колбу-концентратор емкостью 250 мл. Содержимое колбы с пробой промывают 50 мл ацетона, который также фильтруют в колбу-концентратор.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители до объема 10 - 20 мл при температуре +40 °С. В колбу-концентратор добавляют 200 мл бидистиллированной воды, 5,0 мл 10%-ного водного раствора гидроокиси калия, перемешивают встряхиванием и помещают в холодильник с температурой +4 - 6 °С на 2 часа. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр красная лента в делительную воронку емкостью 500 мл. К содержимому воронки добавляют 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, 75 мл дихлорметана и воронку встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Эту процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, приливают 75 мл н-гексана и встряхивают содержимое воронки в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний водный слой собирают в химический стакан емкостью 300 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до рН 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан:этиловый эфир (80:20) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр синяя лента со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан:этиловый эфир (80:20). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители до объема 3 - 5 мл при температуре +40 °С. Остаток экстракта количественно переносят из колбы-концентратора в мерную пробирку со шлифом емкостью 5,0 мл и упаривают растворители досуха в токе азота при температуре +50 °С.

2.6.1.2. Метилирование.

После охлаждения до комнатной температуры в пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного эфирного раствора диазометана (по п. 2.4.4). Пробирку закрывают притертой пробкой и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4 - 6 °С. После этого этиловый эфир в пробирке упаривают досуха в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл изооктана и проводят количественное определение хизалофоп-П кислоты по п. 2.6.3.

2.6.2. Масло рапса.

2.6.2.1. Экстрагирование и очистка экстракта.

Аналитическую пробу масла массой 10,0 +/- 0,1 г растворяют в 50 мл гексана (насыщенного ацетонитрилом) в плоскодонной колбе емкостью 100 мл и после этого гексановый раствор масла переносят в делительную воронку емкостью 250 мл. Колбу промывают 50 мл ацетонитрила (насыщенного гексаном) и также переносят его в воронку. Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний ацетонитрильный слой сливают в колбу-концентратор емкостью 250 мл. В делительную воронку добавляют еще 50 мл ацетонитрила (насыщенного гексаном). Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут, отстаивают и нижний ацетонитрильный слой объединяют в колбе-концентраторе с предыдущим. Верхний гексановый слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным ацетонитрильным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель до объема 10 - 20 мл при температуре +50 °С. В колбу-концентратор добавляют 200 мл дистиллированной воды, 5,0 мл 10%-ного водного раствора гидроокиси калия, раствор перемешивают встряхиванием и выдерживают 2 часа в холодильнике с температурой +4 - 6 °С. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр белая лента в делительную воронку емкостью 500 мл. К содержимому воронки добавляют 10 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, 75 мл дихлорметана и воронку встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Эту процедуру очистки экстракта повторяют два раза с использованием каждый раз по 50 мл дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 мл насыщенного водного раствора хлористого натрия, приливают 75 мл н-гексана и встряхивают содержимое воронки в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний водный слой собирают в химический стакан емкостью 300 мл, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до рН 2,0 и переносят в чистую делительную воронку емкостью 500 мл. В воронку добавляют 75 мл смеси гексан:этиловый эфир (80:20) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр синяя лента со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор емкостью 150 мл. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 мл смеси гексан:этиловый эфир (80:20). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители до объема 3 - 5 мл при температуре +40 °С. Остаток экстракта количественно переносят из колбы-концентратора в мерную пробирку со шлифом емкостью 5,0 мл и упаривают растворители досуха в токе азота при температуре +50 °С.

2.6.2.2. Метилирование.

После охлаждения до комнатной температуры в пробирку с сухим остатком добавляют 2,0 мл свежеприготовленного эфирного раствора диазометана (по п. 2.4.4). Пробирку закрывают притертой пробкой и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4 - 6 °С. После этого этиловый эфир в пробирке упаривают досуха в токе азота при комнатной температуре. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл изооктана и проводят количественное определение хизалофоп-П кислоты по п. 2.6.3.

2.6.3. Условия хроматографирования.

Газовый хроматограф с ТИД.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая длиной 15 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой SE-52, толщина слоя - 0,45 мкм.

Температура колонки: программирование от 180 °С (1 мин.) до 280 °С (15 мин.) со скоростью 10 °С/мин. Температура испарителя: 250 °С. Температура детектора: 290 °С.

Расход газов: газа-носителя (гелий марки "А") - 2,5 куб. см/мин., водорода и воздуха к ТИД - 30 и 250 куб. см/мин. соответственно, дополнительного газа (гелий марки "А") к ТИД - 30 куб. см/мин. Объем вводимой пробы: 2 мкл.

Время удерживания хизалофоп-П кислоты (в виде производного): 13,7 +/- 0,1 мин.

Предел детектирования: 0,25 нг.

Линейный диапазон детектирования: 0,5 - 4,0 нг.

2.6.4. Обработка результатов анализа.

Содержание хизалофоп-П кислоты рассчитывают методом внешнего стандарта по формуле:

При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

ВНИИ защиты растений, Санкт-Петербург.