"МУК 4.1.1853-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств тиаклоприда зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 05.03.2004)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Байер.

Торговое наименование: Калипсо-ультра.

Действующее вещество: тиаклоприд.

Структурная формула (не приводится).

М-[3-(6-хлорпиридин-3-илметил)-тиазолидин-2-илиден]-цианамид (IUPAC).

[3-[(6-хлор-3-пиридинил)метил]-2-тиазолидинилиден]-цианамид (С.А.).

Кристаллическое вещество желтоватого цвета без запаха.

Температура плавления: 136 °С.

Растворимость (г/л) при 20 °С: н-гептан - < 0,1, ксилол - 0,3, ацетон - 64, дихлорметан - 160, изопропанол - 3,0, ацетонитрил - 52, вода - 0,185.

Гигиенические нормативы для тиаклоприда в России:

ОДК в почве - 0,07 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,004 мг/л (с-т); ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,4 мг/куб. м; ВМДУ для яблок - 0,02 мг/кг. Для хлебных злаков гигиенические нормативы в России не установлены.

Тиаклоприд - инсектицид нервно-паралитического действия, эффективно уничтожает тлю, цветоеда, минеров, трипсов, плодожорку, колорадского жука на хлопчатнике, табаке, картофеле, рисе, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода.

2.1. Основные положения

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определение тиаклоприда методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.2. Реактивы и материалы

Ацетон, о.с.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-3716-80.

Тиаклоприд, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98,4% (Bayer).

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (20:80, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0.040-0.063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (50:50, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (10:90, по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

2.3. Приборы и посуда

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Колонка Symmetry C-18, (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters).

Предколонка Waters Symmetry C-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ10 и КШ250 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 500 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Колонки стеклянные (25 х 1) см.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом зерно измельчают на лабораторной, а солому - на ножевой мельнице.

2.5. Подготовка к определению

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry C-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для получения 50%-ного водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления 1 М раствора NaOH 40 г едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см, растворяют при перемешивании в 600 куб. см дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки. Для приготовления 0,02 М раствора NaOH 20 мл 1 М раствора едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с водой в соотношении 28:72 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 мл смешивают 500 мл н-гексана и 500 мл этилацетата. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 мл смешивают 100 мл н-гексана и 900 мл этилацетата.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску тиаклоприда (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил:вода (28:72, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты открывания тиаклоприда используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/мл готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация тиаклоприда в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации тиаклоприда в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 мл смеси гексан - этилацетат (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 мл элюента N 2 и 30 мл элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения тиаклоприда на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора тиаклоприда с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 75 мл элюента N 1, которые отбрасывают, затем 100 мл элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание тиаклоприда по п. 2.6.4.

Фракции, содержащие тиаклоприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.4. Рассчитывают содержание тиаклоприда в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания тиаклоприда и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6. Проведение определения

2.6.1. Извлечение тиаклоприда из проб зерна и соломы зерновых колосовых культур.

Навеску измельченной на ножевой мельнице соломы (5 г) или размолотого на лабораторной мельнице зерна (20 г) помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон - вода (1:1, по объему) и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 мл 50%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (75 - 80 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.2.

2.6.2. Очистка экстрактов

Полученные по п. 2.6.2 водные экстракты доводят до объема 100 мл дистиллированной водой, промывают в делительной воронке объемом 250 мл 20 мл гексана (верхний органический слой отбрасывают), встряхивая делительную воронку в течение 1 - 2 минут. Водную фазу экстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 мл, встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая нижний органический слой <*>. Объединенный метиленхлоридный раствор промывают в делительной воронке дважды 0,02 М раствором NaOH порциями по 30 мл, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл хлористого метилена. После этого экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

--------------------------------

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку: на стадии промывки экстрактов гексаном - небольшое количество (до 5 мл) этилового спирта, а на стадии переэкстракции - насыщенный раствор хлорида натрия (15 - 20 мл).

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов растительных материалов, количественно переносят двумя 5-мл порциями смеси гексан - этилацетат (50:50, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 75 мл элюента N 1. Элюат отбрасывают. Тиаклоприд элюируют 70 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 мл. Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы Waters с УФ-детектором (Waters 2487).

Рабочая длина волны 244 нм.

Колонка Symmetry C-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA),

Предколонка Waters Symmetry C-18 для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 28:72.

Скорость потока 1 мл/мин.

Время удерживания тиаклоприда 10,9 +/- 0,2 мин.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,0 мкг/мл.

2.6.5. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание тиаклоприда в образцах зерна и соломы зерновых колосовых культур (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств тиаклоприда в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор тиаклоприда 2 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

При проведении работы необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе в химических лабораториях, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и других используемых приборов.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

ВНИИ защиты растений.