Описание
Источник публикации
М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2006
Примечание к документу
Документ включен в
Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического
регламента Таможенного союза "О безопасности пищевой продукции" (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки (подтверждения) соответствия продукции (
Решение Комиссии Таможенного союза от 09.12.2011 N 880).
Документ включен в
Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (
Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 N 01/14262-8-32).
Документ
введен в действие с 1 июля 2005 года.
Название документа
"МУК 4.1.1962-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение фумонизинов В1 и В2 в кукурузе (зерно, крупа, мука) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 21.04.2005)
"МУК 4.1.1962-05. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение фумонизинов В1 и В2 в кукурузе (зерно, крупа, мука) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 21.04.2005)
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г.Г.ОНИЩЕНКО
21 апреля 2005 года
4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУМОНИЗИНОВ В1 И В2 В КУКУРУЗЕ (ЗЕРНО, КРУПА,
МУКА) МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
МУК 4.1.1962-05
Дата введения
1 июля 2005 года
1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А. Тутельян, д.х.н. К.И. Эллер, к.х.н. М.Г. Киселева, к.б.н. Л.П. Захарова, И.Б. Седова).
2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г. Онищенко 21 апреля 2005 г.
3. Введены в действие с 1 июля 2005 г.
4. Введены впервые.
1. Назначение и область применения
Настоящий документ устанавливает Методику обнаружения,
идентификации и количественного определения фумонизинов В и В в
1 2
продовольственном сырье и пищевых продуктах методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Данная Методика
испытана и рекомендуется для количественного определения
фумонизинов В и В (ФВ и ФВ ) в зерне кукурузы и продуктах
1 2 1 2
переработки кукурузы.
Методические указания предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции центрами гигиены и эпидемиологии, а также для предприятий и организаций, осуществляющих контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованных в установленном порядке.
Предел обнаружения метода: 0,01 мг/кг (для ФВ ); 0,04 мг/кг
1
(для ФВ ).
2
Общая погрешность измерений не превышает 31%.
Фумонизины принадлежат к большой группе микотоксинов,
продуцируемых микроскопическими грибами рода Fusarium. Наиболее
часто в природных условиях встречается фумонизин В , значительно
1
реже и в меньших количествах - фумонизины В и В (ФВ , ФВ и
2 3 1 2
ФВ ). Подтверждено, что основными продуцентами этих токсинов
3
являются F. moniliforme Sheldon (син. F. verticillioides (Sacc.
Nirenberg)). Имеются данные о высокой частоте обнаружения
фумонизинов в зерне кукурузы и продуктах ее переработки в США,
Австралии, в ряде стран Европы.
Фумонизины представляют собой диэфиры пропан-1,2,3-трикарбоновой кислоты и 2-амино-12,16-диметилполигидроксиэйкозана, хорошо растворимы в воде и полярных растворителях. Фумонизины не обладают естественной флуоресценцией и не имеют специфических хромофоров, что обусловливает необходимость стадии дериватизации для проведения высокочувствительного определения.
Фумонизины в экспериментах in vivo поражают печень, почки,
поджелудочную железу и центральную нервную систему у разных видов
животных, а также обладают канцерогенным действием. Международное
Агентство по изучению рака классифицирует фумонизины, как
соединения потенциально канцерогенные для человека (группа 2В).
Комитет экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам
предложил установить величину допустимого суточного потребления
(ДСП) ФВ + ФВ + ФВ с пищей на уровне 2 мкг/кг массы тела.
1 2 3
Метод включает следующие этапы.
Экстракция ФВ и ФВ из проб зерна кукурузы, муки, крупы
1 2
осуществляют смесью ацетонитрил-вода (50:50% об.). В пробах
детского питания и многокомпонентных пищевых продуктах - смесью
ацетонитрил-метанол-вода (25:25:50% об.):
- очистка и концентрирование пробы на патронах, заполненных
силикагелем, химически связанным с октадецилселаном (ОДС-патроны).
В пробах детского питания и многокомпонентных пищевых продуктах
очистка проводится на иммунно-афинных колонках (ИА-колонки);
- дериватизация фумонизинов о-фталевым реагентом;
- определение ФВ и ФВ с помощью высокоэффективной жидкостной
1 2
хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором при длине
волны возбуждения (лямбда ) 335 нм и длине волны эмиссии
возб.
(лямбда ) 440 нм.
эмис.
Предел обнаружения метода: 0,01 мг/кг (для ФВ ); 0,04 мг/кг
1
(для ФВ ).
2
Относительное стандартное отклонение измерения времени
удерживания составляет - 0,02 (для ФВ ) и 0,03 (для ФВ ), высот
1 2
хроматографических пиков - 0,05 (для ФВ ) и 0,08 (для ФВ ),
1 2
площадей хроматографических пиков - 0,06 (для ФВ ) и 0,08 (для
1
ФВ ).
2
Степень извлечения добавленных в продукт фумонизинов
составляет 89,8% для ФВ и 89,5% для ФВ .
1 2
4. Характеристика погрешностей измерения
Данные Методические указания обеспечивают выполнение измерений с погрешностью, не превышающей величин, приведенных в табл. 1.
Таблица 1
ПРИПИСАННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОГРЕШНОСТЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФВ И ФВ В ПРОДУКТЕ МЕТОДОМ
1 2
ВЭЖХ ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ P = 0,95
??????????????????????????????????????????????????????????????????
?Концентрация, ? Токсин ?Относительная погрешность, +/- дельта, %?
? мг/кг ? ??????????????????????????????????????????
? ? ? Способ твердофазной экстракции ?
? ? ??????????????????????????????????????????
? ? ? С18 ? ИА ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 0,1 ? ФВ ? 7 ? 31 ?
? ? 1 ? ? ?
? ? ФВ ? - ? 29 ?
? ? 2 ? ? ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 0,5 ? ФВ ? 8 ? 11 ?
? ? 1 ? ? ?
? ? ФВ ? 18 ? 15 ?
? ? 2 ? ? ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 1,0 ? ФВ ? 13 ? 8 ?
? ? 1 ? ? ?
? ? ФВ ? 11 ? 13 ?
? ? 2 ? ? ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 5,0 ? ФВ ? 13 ? 17 ?
? ? 1 ? ? ?
? ? ФВ ? 3 ? 17 ?
? ? 2 ? ? ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
посуда, реактивы и материалы
Система ВЭЖХ, состоящая из насоса высокого давления, инжектора типа Rheodyne-7125 (США) с объемом петли-дозатора 20 мкл, спектрофлуориметрического детектора, обеспечивающего возбуждение флуоресценции в спектральной области 330 - 340 нм и регистрацию эмиссии флуоресценции при длине волны 440 нм и системы для сбора и обработки данных типа Мультихром (Амперсенд, Россия) или аналогичной, хроматографической колонки (250 x 4,6 мм), заполненной сорбентом Kromasil С18 (MetaChem Texnologies, США), размер частиц 5 мкм, или подобным сорбентом.
Микрошприцы на МШ-10 или МШ-25 мкл для ВЭЖХ
Дозатор пипеточный от 1 до 5 мл
Дозатор пипеточный от 40 до 200 мкл
вместимостью 100 мл тип 2-100 и 2-250
5.2. Вспомогательное оборудование
Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С ТУ 64-1-2451
или аналогичный
Ротационный испаритель ИР-1М с ловушкой или ТУ 25-11917
аналогичный
Мельница лабораторная роторная "Амита-04"
или аналогичная
Центрифуга лабораторная, обеспечивающая
скорость вращения 2500 об./мин.
Система для твердофазной экстракции
(вакуумная или аналогичная)
Электрошкаф сушильный лабораторный с ТУ 16-531.639
погрешностью поддержания температуры
+/- 2,5 в интервале от 50 до 350 °C
Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А ТУ 46-22-236-79
или аналогичная
pH-метр МР 230 (Испания) или аналогичный
ОДС-патроны (Германия), плотность прививки групп -
1,6 мкмоль/кв. м, содержание углерода - 18,5%,
средний размер частиц - 58 мкм, масса сорбента
в патроне - 100 мг
Иммунно-афинные колонки Fumoniprep
(R-Biopharm, Германия)
Магнитная мешалка типа ММ 5 с перемешивающим ТУ 25-11.834-80
стержнем
ИС NORMPROD: примечание.
В официальном тексте документа, видимо, допущена опечатка:
стандарт имеет номер ГОСТ 10394-72, а не ГОСТ 10394-74.
ИС NORMPROD: примечание.
Взамен ГОСТ 10394-72 Постановлением Госстандарта СССР
от 15.07.1982 N 2670 с 1 января 1984 года введен в действие
Колбы плоскодонные конические, 100 мл, ГОСТ 10394-74
НШ 29, тип КнКШ 100/29/32
Флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного
стекла, объемом 4 мл (вайлы)
Флаконы стеклянные завинчивающиеся из темного
стекла, объемом 7 мл
тип 2-100-2, 2-500-2
5.3. Реактивы и материалы
Стандарт ФВ , фирмы "Sigma", кат. N F 1147
1
Стандарт ФВ , фирмы "Sigma", кат. N F 3771
2
Стандартные растворы ФВ и ФВ в смеси
1 2
ацетонитрил-вода (50:50% об.),
с концентрацией 10 мг/л
Фильтры обеззоленные "синяя лента" ТУ 6-09-1678
12-водный, чда
2-водный, чда
Ацетонитрил, осч, сорт 0, УФ-поглощение
на 200 нм о.е./1 см
о-Фталевый альдегид, фирмы "Sigma",
кат. N 0657
2-Меркапэтанол, фирмы "Fluka", чистота
более 99%
Ортофосфорная кислота, осч ТУ 2612-014-00203677-97
0,1 М фосфатный буферный раствор, pH 3,0
0,1 М фосфатный буферный раствор, pH 3,0
0,08 М фосфатный буферный раствор, pH 4,5
0,025 М фосфатный буферный раствор, pH 7,0
6. Подготовка к выполнению измерений
6.1. Приготовление стандартных и рабочих растворов
ФВ и ФВ
1 2
Для приготовления стандартных растворов микотоксинов рекомендуется использовать растворители, очищенные перегонкой.
Для получения раствора хранения фумонизинов с концентрацией 50 мг/л в мерную колбу вместимостью 100 мл помещают навеску фумонизина (5 мг), взятую с точностью до 0,01 мг, приливают небольшое количество смеси ацетонитрил-вода (1:1) и тщательно перемешивают до полного растворения вещества, доводят смесь до метки.
Для получения исходных рабочих растворов фумонизинов с концентрацией стандарта 10 мг/л следует в 5 раз разбавить раствор хранения фумонизинов.
Из исходных рабочих растворов ФВ и ФВ с концентрациями 10
1 2
мг/л сначала готовится их смесь в соотношении (1:1), а затем путем
последовательного разбавления этой смеси готовят рабочий
стандартный раствор, для чего необходимую аликвоту смеси
микотоксинов доводят до соответствующего объема смесью
ацетонитрил-вода (1:1) согласно
табл. 2.
Например: для приготовления смеси стандартных растворов ФВ и
1
ФВ с концентрациями по 5 мг/л в вайл вносят по 1 мл исходных
2
рабочих растворов ФВ и ФВ с концентрациями 10 мг/л.
1 2
Для приготовления смеси рабочих стандартных растворов ФВ и
1
ФВ с концентрацией:
2
- 2,0 мг/л - в вайл вносят 800 мкл смеси ФВ и ФВ с
1 2
концентрацией 5 мг/л и добавляют 1200 мкл смеси ацетонитрил-вода
(1:1);
- 1,0 мг/л - в вайл вносят 400 мкл смеси ФВ и ФВ с
1 2
концентрацией 5 мг/л и добавляют 1600 мкл смеси ацетонитрил-вода
(1:1) или 1000 мкл смеси рабочих стандартных растворов ФВ и ФВ с
1 2
концентрацией 2 мг/л добавляют 1000 мкл смеси ацетонитрил-вода
(1:1);
- 0,4 мг/л - в вайл вносят 800 мкл смеси ФВ и ФВ с
1 2
концентрацией 1 мг/л и добавляют 1200 мкл смеси ацетонитрил-вода
(1:1);
- 0,2 мг/л - в вайл вносят 1000 мкл смеси ФВ и ФВ с
1 2
концентрацией 0,4 мг/л и добавляют 1000 мкл смеси ацетонитрил-вода
(1:1). При необходимости по аналогии с вышеизложенным делается
нужное разбавление.
Таблица 2
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ ФВ И ФВ
1 2
??????????????????????????????????????????????????????????????????
?Получаемые кон-? Приготовление смеси стандартных растворов ?
?центрации смеси? ?
?стандартных ра-? ?
?створов ? ?
?ФВ и ФВ , мг/л? ?
? 1 2 ? ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 5,0 ?1 мл ФВ (с = 10 мг/л) + 1 мл ФВ (с = 10 мг/л) ?
? ? 1 2 ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 2,0 ?800 мкл смеси ФВ и ФВ (с = 5 мг/л) + 1200 мкл ?
? ? 1 2 ?
? ?смеси ацетонитрил-вода (1:1) ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 1,0 ?400 мкл смеси ФВ и ФВ (с = 5 мг/л) + 1600 мкл ?
? ? 1 2 ?
? ?смеси ацетонитрил-вода (1:1) или 1000 мкл смеси ?
? ?ФВ и ФВ (с = 2 мг/л) + 1000 мкл смеси ацетони-?
? ? 1 2 ?
? ?трил-вода (1:1) ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 0,4 ?800 мкл смеси ФВ и ФВ (с = 1 мг/л) + 1200 мкл ?
? ? 1 2 ?
? ?смеси ацетонитрил-вода (1:1) ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 0,2 ?1000 мкл смеси ФВ и ФВ (с = 0,4 мг/л) + 1000 ?
? ? 1 2 ?
? ?мкл смеси ацетонитрил-вода (1:1) ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
6.2. Хранение стандартных растворов фумонизинов
Растворы хранения фумонизинов следует держать в стеклянной посуде с притертыми пробками в темном прохладном месте (при температуре около 0 °C) до одного года и использовать для приготовления рабочих стандартных растворов. Смеси рабочих стандартных растворов хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °C) в течение 1 недели.
Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.
6.3. Приготовление буферных растворов
6.3.1. Приготовление 0,1 М фосфатного буферного раствора, pH = 3,0
Навеску натрия фосфорно-кислого однозамещенного, 2-водного массой 7,8 г переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл, добавляют 20 - 50 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
6.3.2. Приготовление 0,08 М фосфатного буферного раствора, pH = 4,5
Навеску натрия фосфорно-кислого однозамещенного, 2-водного массой 6,24 г переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл, добавляют 20 - 50 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
6.3.3. Приготовление 0,025 М фосфатного буферного раствора, pH = 7,0
Навеску натрия фосфорно-кислого двузамещенного, 12-водного массой 0,895 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 10 - 20 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
6.3.4. Приготовление фосфатного буферного раствора, pH = 7,4
Навеску натрия фосфорно-кислого двузамещенного, 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного, 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют 10 - 20 мл дистиллированной воды. Доводят объем раствора в колбе до метки и перемешивают. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.
7. Отбор и подготовка проб для анализа
Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:
- "Крупа. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 27312-84;
- "Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию",
ГОСТ 8756.0-70.
Для получения среднего образца зерна, представительного по концентрации микотоксинов для всей партии, следует измельчить до гомогенизированного состояния двухкилограммовый исходный образец и выделить из этого размола средний образец зерна.
Для однородных продуктов (мука, крупа, детское питание, хлопья и др.) пробы следует отбирать в количестве единиц упаковки, соответствующих величине среднего образца (100 - 200 г), при условии, что продукт происходит из одной партии.
7.2. Подготовка проб для анализа
Отобранные пробы измельчают в течение 1 - 2 мин. в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы и одну - холостую.
7.2.1. Экстракция
7.2.1.1. Для однокомпонентных пищевых продуктов: навеску 10 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 100 мл, добавляют 50 мл смеси ацетонитрил-вода (50:50% об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 90 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр "синяя лента". Отбирают 5 мл фильтрата и добавляют 5 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора, pH = 3,0. Полученный раствор центрифугируют в течение 15 мин. при 2,5 тыс. об./мин.
7.2.1.2. Для проб детского питания и многокомпонентных пищевых
продуктов экстракцию ФВ и ФВ из 10 г измельченной пробы проводят
1 2
встряхиванием в 50 мл смеси ацетонитрил-метанол-вода (25:25:50%
об.) в течение 120 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр
"синяя лента". К 2 мл супернатанта добавляют 8 мл фосфатного
буферного раствора, pH = 7,4 и центрифугируют в течение 15 мин.
при 2,5 тыс. об./мин.
7.2.2. Очистка экстракта
7.2.2.1. Для однокомпонентных пищевых продуктов: перед использованием ОДС-патроны предварительно кондиционируют, пропуская последовательно по 2 мл ацетонитрила и 0,1 М фосфатного буферного раствора, pH = 3,0. Затем на патрон наносят 8,0 мл анализируемого экстракта и промывают 1,0 мл 0,1 М фосфатным буферным раствором, pH = 3. Фумонизины элюируют с патрона 2,0 мл смеси ацетонитрил-0,025 М фосфатного буферного раствора, pH = 7,0 (70:30% об.).
7.2.2.2. Для очистки проб детского питания и многокомпонентных пищевых продуктов на ИА-колонку наносят со скоростью 1 - 2 капли в секунду 8 мл полученного раствора, промывают 10 мл фосфатного буферного раствора, pH = 7,4. Фумонизины элюируют с колонки 1,5 мл метанола и 1,5 мл дистиллированной воды.
8.1. Дериватизация фумонизинов о-фталевым альдегидом
Для приготовления ОФА-реагента 40 мг о-фталевого альдегида растворяют в 1 мл метанола, добавляют 5 мл 0,05 М водного раствора тетрабората натрия и 50 мкл 2-меркаптоэтанола. Полученный раствор хранят в темноте в течение 1 недели при t = 6 °C.
Дериватизацию фумонизинов о-фталевым альдегидом проводили в течение 1 мин. после смешивания 40 мкл пробы и 40 мкл ОФА-реагента.
8.2. Определение фумонизинов В и В методом ВЭЖХ
1 2
Условия ВЭЖХ: подвижная фаза ацетонитрил-метанол-0,08 М фосфатный буферный раствор (50:10:40% об.), pH 4,5, скорость подвижной фазы 1,3 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанный метанол, ацетонитрил и бидистиллированную воду. Все растворители необходимо предварительно отфильтровать.
Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 335 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 440 нм.
9. Обработка результатов измерения
9.1. Для построения калибровочного графика проводят
хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В
инжектор с помощью микрошприца вводят 20 мкл перемешенной в
течение 1 мин. смеси, состоящей из 40 мкл ОФА-реагента и 40 мкл
рабочего раствора стандарта с концентрацией 5 мг/л, что
соответствует 100 нг ФВ и 100 нг ФВ . Подобное делается для
1 2
других стандартных растворов с концентрациями по 2,0, 1,0, 0,4,
0,2 мг/л, что в свою очередь соответствует 40, 20, 8 и 4 нг ФВ и
1
ФВ во вколе. На основании полученных данных строят калибровочную
2
кривую (зависимость площади хроматографического пика от
концентрации фумонизина во вколе). В интервале линейности
градуировочный график описывается уравнением прямой:
S = a x c + b,
где:
S - площадь хроматографического пика;
c - концентрация фумонизина в очищенном экстракте, мг/кг;
a, b - коэффициенты градуировочного графика.
Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью
микрошприца 20 мкл смеси, перемешенной в течение 1 мин. и
состоящей из 40 мкл ОФА-реагента и 40 мкл очищенного экстракта.
При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с ФВ или
1
ФВ , рассчитывают их концентрацию в очищенном экстракте с помощью
2
уравнения градуировочного графика.
Для того, чтобы рассчитать содержание фумонизинов в исходном
образце необходимо концентрацию ФВ и ФВ в пробе умножить на
1 2
коэффициент разбавления.
9.2. Коэффициент разбавления в случае использования С-18
колонок:
V x V x V
1 3 5
Кр = ------------ = 2,5,
М x V x V
2 4
где:
Кр - коэффициент разбавления;
V - объем смеси ацетонитрил-вода, взятой для экстракции, мл
1
(50 мл);
М - навеска образца, взятого для анализа, г (10 г);
V - объем водно-ацетонитрильного экстракта, взятого для
2
анализа, мл (5 мл);
V - объем смеси водно-ацетонитрильного экстракта и фосфатного
3
буфера, взятых для центрифугирования, мл (10 мл);
V - объем смеси после центрифугирования, взятой для
4
твердофазной очистки, мл (8 мл);
V - объем собранного элюата после стадии твердофазной
5
очистки, мл (2 мл).
Расчет концентрации ФВ и ФВ в пробе проводится по формуле:
1 2
C = 2,5 x C ,
(ФВ ) э(ФВ )
1 1
C = 2,5 x C ,
(ФВ ) э(ФВ )
2 2
где:
C - концентрация ФВ и ФВ , мг/кг;
1 2
2,5 - коэффициент разбавления;
C - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг;
э(ФВ ) 1
1
C - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг.
э(ФВ ) 2
2
При высоких уровнях загрязнения фумонизинами кукурузы или
продуктов ее переработки, экстракт перед реакцией дериватизации
необходимо разбавить, в этом случае при расчете содержания
фумонизинов в исходном образце, необходимо дополнительно учесть
это разбавление (К ):
д.р.
C = 2,5 x К x C ,
(ФВ ) д.р. э(ФВ )
1 1
C = 2,5 x К x C ,
(ФВ ) д.р. э(ФВ )
2 2
где К - коэффициент дополнительного разбавления экстракта.
д.р.
В указанных условиях время удерживания находится для ФВ в
1
диапазоне от 7,0 до 8,5, для ФВ - 24 - 27 мин. Примерный вид
2
хроматограммы, полученной с помощью модельной смеси, где C =
(ФВ )
1
C = 0,5 мг/кг, представлен на рис. 1 (не приводится).
(ФВ )
2
9.2. Коэффициент разбавления в случае использования
ИА-колонок:
V x V x V
1 3 5
Кр = ------------ = 9,375,
М x V x V
2 4
Кр - коэффициент разбавления;
V - объем смеси ацетонитрил-метанол-вода, взятой для
1
экстракции, мл (50 мл);
М - навеска образца, взятого для анализа, г (10 г);
V - объем ацетонитрил-метанол-водного экстракта, взятого для
2
анализа, мл (2 мл);
V - объем смеси ацетонитрил-метанол-водного экстракта и
3
фосфатного буферного раствора, взятых для центрифугирования, мл
(10 мл);
V - объем смеси после центрифугирования, взятой для
4
твердофазной очистки, мл (8 мл);
V - объем собранного элюата после стадии твердофазной
5
очистки, мл (3 мл).
Расчет концентрации ФВ и ФВ в пробе проводится по формуле:
1 2
C = 9,375 x C ,
(ФВ ) э(ФВ )
1 1
C = 9,375 x C ,
(ФВ ) э(ФВ )
2 2
где:
C - концентрация ФВ и ФВ , мг/кг;
1 2
9,375 - коэффициент разбавления;
C - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг;
э(ФВ ) 1
1
C - концентрация ФВ в очищенном экстракте, мг/кг.
э(ФВ ) 2
2
При высоких уровнях загрязнения фумонизинами кукурузы или
продуктов ее переработки, экстракт перед реакцией дериватизации
необходимо разбавить, в этом случае при расчете содержания
фумонизинов в исходном образце, необходимо дополнительно учесть
это разбавление (К ):
д.р.
C = 9,375 x К x C ,
(ФВ ) д.р. э(ФВ )
1 1
C = 9,375 x К x C ,
(ФВ ) д.р. э(ФВ )
2 2
где К - коэффициент дополнительного разбавления экстракта.
д.р.
10. Вычисление результатов анализа
За окончательный результат испытаний принимается среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений.
C = (C + C ) / 2,
(ФВ )ср (ФВ )1 (ФВ )2
1 1 1
C = (C + C ) / 2.
(ФВ )ср (ФВ )1 (ФВ )2
2 2 2
Определяют допустимое расхождение между параллельными определениями r, используя r, % из
табл. 3.
r = 0,01 x (r , %) x C , мг/кг,
1 1 (ФВ )
1
r = 0,01 x (r , %) x C , мг/кг.
2 2 (ФВ )
2
Если расхождение между параллельными определениями не
превышает допустимого:
|C - C | <= r ,
(ФВ )1 (ФВ )2 1
1 1
|C - C | <= r ,
(ФВ )1 (ФВ )2 2
2 2
то среднее арифметическое принимают за результат анализа.
Таблица 3
ЗНАЧЕНИЕ НОРМАТИВОВ ОПЕРАТИВНОГО КОНТРОЛЯ СХОДИМОСТИ
ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ P = 0,95
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? Концентрация, ? Токсин ? Норматив оперативного контроля ?
? мг/кг ? ? сходимости, r, % ?
? ? ?????????????????????????????????????
? ? ? Способ твердофазной экстракции ?
? ? ?????????????????????????????????????
? ? ? С18 ? ИА ?
? ? ?????????????????????????????????????
? ? ? r , % ? r , % ?
? ? ? 1 ? 2 ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 0,1 ? ФВ ? 33 ? 10 ?
? ? 1 ? ? ?
? ? ФВ ? - ? 26 ?
? ? 2 ? ? ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 0,5 ? ФВ ? 28 ? 12 ?
? ? 1 ? ? ?
? ? ФВ ? 30 ? 5 ?
? ? 2 ? ? ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 1,0 ? ФВ ? 24 ? 9 ?
? ? 1 ? ? ?
? ? ФВ ? 22 ? 26 ?
? ? 2 ? ? ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
? 5,0 ? ФВ ? 30 ? 32 ?
? ? 1 ? ? ?
? ? ФВ ? 28 ? 30 ?
? ? 2 ? ? ?
??????????????????????????????????????????????????????????????????
При превышении норматива r следует повторить измерения, используя резервные пробы. В случае повторного превышения указанного норматива, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам анализа, устраняют их и повторяют анализ пробы.
11. Оперативный контроль результатов измерения
11.1. Алгоритм проведения оперативного контроля
воспроизводимости
Периодичность контроля воспроизводимости измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
Пробами для контроля являются рабочие пробы продуктов, продовольственного сырья. Отбирают 2 пробы, которые анализируют в точном соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа, а именно используя разные наборы мерной посуды, разные партии реактивов и участие двух разных аналитиков. Целесообразно также проведение анализа этих аналитических проб в разных лабораториях.
11.2. Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности
Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.
Образцами контроля являются рабочие пробы пищевых продуктов
или продовольственного сырья. Отбирают пробу и разделяют ее на 2
равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой
добавляют раствор стандартов ФВ и ФВ в таком количестве, чтобы
1 2
массовая доля каждого из них в пробе по сравнению с исходным
значением увеличилась на 50 - 100%. Добавка должна вводиться в
пробу перед началом пробоподготовки.
Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью
методики и получают результаты анализа исходной пробы (C и
(ФВ )
1
C ), мг/кг, и пробы с добавкой (C' и C' ).
(ФВ ) (ФВ ) (ФВ )
2 1 2
Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ
проводит один аналитик с использованием одного набора мерной
посуды, реактивов, растворов и т.д.
Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с
использованием метода добавок состоит в сравнении результата
контрольного определения, равного разности между результатом
контрольного измерения пробы с добавкой (C и C' ), пробы
(ФВ ) (ФВ )
1 2
без добавки (C и C ) и величиной добавки (C и
(ФВ ) (ФВ ) доб(ФВ )
1 2 1
C ), с нормативом оперативного контроля К. Решение об
доб(ФВ )
2
удовлетворительной погрешности принимается при выполнении условия
(при P = 0,95):
|C' - C - C | <= К,
(ФВ ) (ФВ ) доб(ФВ )
1 1 1
|C' - C - C | <= К.
(ФВ ) (ФВ ) доб(ФВ )
2 2 2
Норматив оперативного контроля погрешности рассчитывают по
формулам при проведении:
- внутрилабораторного контроля (P = 0,90):
2 2 1/2
К = 0,84 x (ДЕЛЬТА C' + ДЕЛЬТА C ) , мг/кг,
(ФВ ) (ФВ )
1 1
2 2 1/2
К = 0,84 x (ДЕЛЬТА C' + ДЕЛЬТА C ) , мг/кг;
(ФВ ) (ФВ )
2 2
- внешнего контроля (P = 0,95):
2 2 1/2
К = (ДЕЛЬТА C' + ДЕЛЬТА C ) , мг/кг,
(ФВ ) (ФВ )
1 1
2 2 1/2
К = (ДЕЛЬТА C' + ДЕЛЬТА C ) , мг/кг,
(ФВ ) (ФВ )
2 2
где:
2 2
ДЕЛЬТА C' , ДЕЛЬТА C' - абсолютные погрешности
(ФВ ) (ФВ )
1 2
измерений для исходной пробы с добавкой, мг/кг;
2 2
ДЕЛЬТА C , ДЕЛЬТА C - абсолютные погрешности
(ФВ ) (ФВ )
1 2
измерений для исходной пробы, мг/кг;
2
ДЕЛЬТА C = 0,01 дельта x C ,
(ФВ ) C (ФВ )
1 (ФВ ) 1
1
2
ДЕЛЬТА C = 0,01 дельта x C ;
(ФВ ) C (ФВ )
2 (ФВ ) 2
2
C , C - содержание определяемых компонентов в пробе;
(ФВ ) (ФВ )
1 2
2
ДЕЛЬТА C' = 0,01 дельта x С' ,
(ФВ ) C' (ФВ )
1 (ФВ ) 1
1
2
ДЕЛЬТА C' = 0,01 дельта x C' ;
(ФВ ) C' (ФВ )
2 (ФВ ) 2
2
дельта и дельта приведены в
табл. 1.
C C'
(ФВ ) (ФВ )
1 2
При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.
12. Требования техники безопасности
При выполнении анализов необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по
ГОСТ 12.1.005,
ГОСТ 12.2.007.0 и
ГОСТ 4658. Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционными системами по
ГОСТ 12.4.021.
13. Требования к квалификации исполнителя
К выполнению анализа ФВ и ФВ в пищевых продуктах допускаются
1 2
лица со специальным высшим образованием или средним специальным
образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие
соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической
лаборатории.
14. Условия выполнения измерений
Температура окружающего воздуха: от 15 до 25 °C.
Относительная влажность воздуха: не более 80% при 25 °C.
Атмосферное давление: 730 - 760 мм рт. ст.
Напряжение электропитания: 210 - 220 В. Частота переменного тока: 45 - 50 ГЦ.
