"МУК 4.1.1804-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств просульфурона в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур, зеленой массе и зерне кукурузы, семенах льна методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Минздрав России 18.12.2003)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (проф. Т.В. Юдина), Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин) при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (гл. специалист А.П. Веселов), под редакцией член-корр. РАМН В.В. Ракитского.

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России (прот. N 20 от 2 декабря 2003 г.).

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 18 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Сингента Кроп Протекшн (Швейцария).

Торговое название: ПИК.

Действующее вещество: просульфурон (АЕ F115005)

1-(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)-3-[2-(3,3,3-трифторпропил)-фенилсульфонил]мочевина (ИЮПАК)

N-[[(4-метокси-6-метил-1,3,5-триазин-2-ил)амино]карбонил]-2-(3,3,3-трифторпропил)бензолсульфонамид(С.А.).

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 419,4.

Химически чистый просульфурон представляет собой белое кристаллическое вещество без запаха.

Температура плавления: 155 °С (с разложением).

Растворимость (г/л) при 25 °С: гексан - 0,0064, толуол - 6,1, этанол - 8,4, этилацетат-56, ацетон - 160, дихлорметан - 180; растворимость в воде (мг/л): 87 (рН 5), 4000 (рН 6,8), 43000 (рН 7,7).

Гербицид практически нетоксичен для птиц, рыб, пчел, диких животных, дождевых червей, дафний и водорослей.

Гигиенические нормативы для просульфурона в России не установлены.

Просульфурон - послевсходовый гербицид системного действия из класса сульфонилмочевин. Вещество достаточно хорошо поглощается листьями и передвигается в акропетальном и базипетальном направлениях в различные органы растения. Просульфурон в дозах от 12 до 40 г д.в. на 1 га эффективно уничтожает однолетние и многолетние двудольные сорные растения в посевах зерновых злаков, кукурузы и сорго, на пастбищах и в дернине. Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Пик, ВДГ (750 г/кг) в качестве гербицида на зерновых колосовых культурах при норме расхода 15 - 45 г/га и однократной обработке за сезон в период от фазы кущения до начала выхода в трубку.

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на определении просульфурона с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором после извлечения препарата из воды хлористым метиленом, из почвы, семян льна и соломы водным ацетонитрилом, из зерна и зеленой массы смесью метанол - фосфатный буфер при ультразвуковой обработке, последующей очистки экстрактов путем перераспределения действующего вещества между несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания зерновых культур, кукурузы и льна.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Просульфурон с содержанием д.в. 99,5% (Сингента, Швейцария).

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-82.

Вода бидистиллированная, ГОСТ 7602-72.

Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калий фосфорнокислый однозамещенный, ч.д.а., ГОСТ 4198-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная, 85,6%, х.ч., ГОСТ 6552-80.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрий фосфорнокислый двузамещенный, 2-х водный, ч.д.а., ГОСТ 11773-76.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Спирт метиловый, х.ч., ГОСТ 6995-77.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Хлористый метилен, ГОСТ 12794-80.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - ацетон (8:2, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан - ацетон (7:3, по объему).

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - метанол - 0,005 М ортофосфорная кислота (38:10:52, по объему).

Силикагель марки Л (40 - 100 мкм) для колоночной хроматографии (Хемапол, Чехия) 1 степени активности, или силикагель КСК (60 - 100 меш).

Стекловата.

Хлопковая вата.

Фильтры бумажные, синяя лента, ТУ 6-09-1678.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Knauer (Германия) или аналогичный.

Хроматографическая колонка стальная длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Диасфером 110-С18 или Диасорбом 130-С16 Т (ЗАО БиоХимМак СТ, РФ; 119899, Москва, Ленинские горы).

Шприц для ввода образцов в жидкостной хроматограф.

Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74.

Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75.

Встряхиватель механический, ТУ 64-1-1081-73.

Иономер ЭВ-74, ГОСТ 22261-76, или аналогичный.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79 или аналогичная.

Ротационный испаритель тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76.

Сито с диаметром отверстий 1 мм.

Баня ультразвуковая, модель D 50, Branson Instr. Co., США или аналогичная.

Воронка Бюхнера, ГОСТ 0147-73.

Воронки делительные вместимостью 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 9737-70.

Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 мл, ГОСТ 1770-74.

Колбы грушевидные вместимостью 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74Е.

Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 и 10 мл, ГОСТ 10515-75.

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 1770-74.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы зерна, семян и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °С не более трех месяцев. Пробы зеленой массы замораживают при температуре -18 °С и хранят в морозильной камере не более трех месяцев. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 °С в течение 2 дней, при температуре -18 °С в течение месяца.

Пробы почвы высушивают при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света до воздушно-сухого состояния и хранят в темном сосуде не более трех месяцев.

Перед анализом зерно, семена и солому размалывают на мельнице, зеленую массу измельчают ножницами, сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130 °С в течение 2 часов.

2.5.5. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

При подготовке подвижной фазы для анализа просульфурона отмеряют 380 мл ацетонитрила и 100 мл метанола, переносят в колбу на 1000 мл, добавляют 520 мл 0,005 М ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют, дегазируют.

2.5.6. Кондиционирование колонки

Промыть колонку для ВЭЖХ 20 мл смеси ацетонитрил - вода (1:1, по объему), а затем смесью ацетонитрил - метанол - 0,005 М ортофосфорная кислота (38:10:52, по объему) (п. 2.5.2) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя 1 мл/мин. Включить детектор и подождать стабилизации базовой линия (5 - 15 минут).

2.5.7. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор просульфурона с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,01 г вещества в метаноле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике при температуре -12 °С не более одного месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,025; 0,05; 0,125 и 0,25 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора просульфурона соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.5) непосредственно в день проведения анализа. Раствор хранят в холодильнике не более суток.

При изучении полноты открывания просульфурона в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.

2.5.8. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 20 мкл рабочего стандартного раствора просульфурона с концентрацией 0,025; 0,05; 0,125 и 0,25 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации препарата в растворе в мкг/мл.

2.5.9. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,0 см вставляют тампон из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 30 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и колонку последовательно промывают 20 мл элюента N 2 (гексан - ацетон, 7:3) и 20 мл элюента N 1 (гексан - ацетон, 8:2) со скоростью 1 - 2 капли в секунду.

2.5.10. Проверка хроматографического поведения просульфурона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора просульфурона с концентрацией 20 мкг/мл, отдувают растворитель потоком теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на подготовленную колонку. Промывают колонку 20 мл элюента N 1 и затем 50 мл элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 5 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.5) и анализируют на содержание просульфурона по п. 2.7.

Фракции, содержащие просульфурон, объединяют и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание: Профиль вымывания просульфурона с колонки может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6.1.2. Почва. Навеску (20 г) воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 125 мл 90%-ного водного ацетонитрила и встряхивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. Суспензию помещают в ультразвуковую баню на 3 минуты и затем фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Остаток почвы на фильтре промывают 75 мл 90%-ного ацетонитрила. Из объединенного фильтрата отбирают аликвоту раствора (около 45 мл), эквивалентную 5 г почвы. Дальнейшую очистку проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.3. Зерно, семена, зеленая масса, солома. Навеску (10 г) размолотого зерна помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 125 мл смеси метанол - фосфатный буфер N 1 рН 7,0 (80:20, по объему) и перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. Суспензию помещают в ультразвуковую баню на 3 минуты и затем фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Остаток на фильтре промывают 75 мл смеси метанол - фосфатный буфер N 1 (80:20, по объему). Из объединенного фильтрата отбирают аликвоту раствора (около 45 мл), эквивалентную 2,5 г зерна.

Навеску (10 г) размолотых семян льна помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 125 мл 90%-ного водного ацетонитрила и перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. Суспензию помещают в ультразвуковую баню на 1 минуту и затем фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Остаток на фильтре промывают 75 мл 90%-ного ацетонитрила. Из объединенного фильтрата отбирают аликвоту раствора (около 45 мл), эквивалентную 2,5 г семян.

Навеску (20 г) измельченной зеленой массы помещают в коническую колбу емкостью 500 мл, приливают 200 мл смеси метанол - фосфатный буфер N 1 (80:20, по объему) и встряхивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Остаток на фильтре промывают 75 мл смеси метанол - фосфатный буфер N 1. Из объединенного фильтрата отбирают аликвоту раствора (около 25 мл), эквивалентную 2 г ткани.

Навеску (5 г) размолотой соломы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл 90%-ного водного ацетонитрила и встряхивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Остаток на фильтре промывают 75 мл 90%-ного ацетонитрила. Из объединенного фильтрата отбирают аликвоту раствора (около 65 мл), эквивалентную 2 г соломы. Дальнейшую очистку экстрактов проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.2. Очистка экстрактов

Отобранные аликвоты растительного (из п. 2.6.1.3) и почвенного (из п. 2.6.1.2) экстрактов упаривают до водного остатка (объем 10 - 15 мл) на роторном испарителе при температуре 40 °С. К оставшемуся водному раствору добавляют 30 мл фосфатного буфера N 2 рН 10 (п. 2.5.4), при необходимости доводят рН раствора до 10 с помощью 2 N раствора гидроксида натрия. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 - 150 мл, промывают трижды смесью гексан - хлористый метилен (20:80, по объему) порциями по 25 мл, которую отбрасывают. Водную фазу переносят в химический стакан и подкисляют 2 М ортофосфорной кислотой до рН 3. Переносят раствор вновь в делительную воронку и просульфурон трижды (30 + 2 х 15 мл) экстрагируют смесью гексан - хлористый метилен (65:35, по объему). Объединенную органическую фазу пропускают через 1-см слой хлопковой ваты и упаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С.

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов зерна, семян, зеленой массы, соломы и почвы, переносят 3 порциями (2 + 2 + 1 мл) элюента N 1 (гексан - ацетон, 8:2) в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.9). Колонку промывают 25 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Вещество элюируют 30 мл элюента N 2 (гексан - ацетон, 7:3), отбрасывая первые 15 мл и собирая последующие 15 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток экстрактов зерна и семян растворяют в 1 мл, почвы - в 2 мл, а зеленой массы и соломы - в 4 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.5) и анализируют на содержание просульфурона по п. 2.7.

Примечание: При использовании новой партии сорбента или растворителей проводится проверка хроматографического поведения просульфурона на колонке с силикагелем.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Knauer (Германия).

Хроматографическая колонка стальная, 4 х 150 мм, заполненная Диасфером 110-С18 (5 мкм).

Подвижная фаза: ацетонитрил - метанол - 0,005 М ортофосфорная кислота (38:10:52, по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Температура колонки: комнатная.

Рабочая длина волны: 226 нм.

Чувствительность: 0,005 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 мкл.

Минимально определяемое количество просульфурона - 0,5 нг.

Время выхода просульфурона: около 14 мин.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С16Т (5 мкм).

Подвижная фаза: ацетонитрил - метанол - 0,005 М ортофосфорная кислота (35:10:55, по объему).

Время выхода просульфурона: около 12 мин.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор концентрацией 0,25 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Содержание просульфурона рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

Назарова Т.А., науч. сотр., канд. биол. наук; Микитюк О.Д., ст. науч. сотр., канд. биол. наук; Макеев А.М., зав. лабораторией, канд. биол. наук.

ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.