"МУК 4.1.1835-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств карбоксина в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 13.02.2004)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Алсико Агропром.

Торговое наименование: Витасил.

Действующее вещество: карбоксин.

Структурная формула (не приводится).

5,6-Дигидро-2-метил-1,4-оксатиин-3-карбоксанилид (IUPAC).

5,6-Дигидро-2-метил-N-фенил-1,4-оксатиин-3-карбоксамид (С.А.).

Мол. масса: 235,3.

Белые кристаллы (технический - белый порошок).

Температура плавления: 91,5 - 92,5 °С и 98 - 100 °С (в зависимости от типа кристаллов).

Мутагенный эффект при использовании препарата не наблюдался. Класс токсичности по ВОЗ - III.

Гигиенические нормативы для карбоксина в России: ОДК в почве - 0,05 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,02 мг/л; МДУ для зерна хлебных злаков, проса, кукурузы - не допускается. Область применения препарата: карбоксин - фунгицид системного действия. Используется для обработки семян пшеницы, овса и ячменя против головневых болезней, корневых гнилей и плесневения семян зерновых культур. Не применяется совместно с пестицидами, имеющими в молекуле длинные углеводородные цепи или обладающими кислой реакцией.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении карбоксина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими несмешивающимися фазами, а также на концентрирующих патронах Диапак С-16.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Бумажные фильтры "синяя лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 6709-72.

Карбоксин, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,7%.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (45:55, по объему).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Патроны Диапак С-16.

Элюент для патронов Диапак С-16: вода - ацетон (70:30, по объему).

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки, или аналогичный.

Колонка Symmetry - С18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA), или аналогичная.

Предколонка Waters Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75.

Воронка Бюхнера, ГОСТ 9147-73.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42-861-64.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Ротационный испаритель, ТУ 25-11-917-76.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы растительных материалов хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, пробы зерна измельчают на лабораторной, а соломы - на ножевой мельнице. Пробы воды хранят в бутылях темного стекла в холодильнике при температуре 1 - 4 °С в течение 3 суток, при температуре -18 °С (в пластиковых бутылях) - в течение месяца.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетонитрил (марки х.ч.) сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку Symmetry - С18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для получения 50%-ного водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 мл ацетона с 500 мл дистиллированной воды, используя мерные цилиндры. Для приготовления подвижной фазы смешивают 450 мл ацетонитрила с 550 мл бидистиллированной воды в колбе на 1000 мл, смесь фильтруют, при необходимости дегазируют. Для приготовления элюента для патронов Диапак С-16 (далее - элюент) в колбе на 1000 мл смешивают 700 мл дистиллированной воды и 300 мл ацетона. Для приготовления 20% раствора хлористого натрия 200 г кристаллического NaCl помещают в мерную колбу на 1 л, растворяют при перемешивании в 800 мл дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

2.5.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску карбоксина (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил:бидистиллированная вода = 45:55, по объему). Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При определении полноты извлечения карбоксина из пробы для внесения в контрольные образцы используют градуировочные растворы.

Внимание! Карбоксин быстро разлагается в водных растворах на свету (см. п. 1), поэтому следует избегать попадания прямого света на пробы и стандартные растворы хранить во флаконах темного стекла.

2.5.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация карбоксина в растворе) в хроматограф вводят по 50 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбоксина в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6. Подготовка патрона Диапак С-16 для очистки экстракта

Концентрирующий патрон Диапак С-16 промывают последовательно с помощью шприца 20 мл ацетона и 20 мл воды со скоростью 5 мл/мин. После чего он готов к работе.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения карбоксина на патроне Диапак С-16

В круглодонную колбу емкостью 100 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора карбоксина с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель потоком теплого воздуха, остаток растворяют в 50 мл воды и наносят на приготовленный по п. 2.5.6 патрон. Колбу обмывают еще 10 мл воды и также наносят на патрон. Элюат отбрасывают. Как только уровень жидкости достигнет верхнего края патрона, его промывают 70 мл элюента. (Нельзя допускать высыхания твердой фазы в патроне.) Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание карбоксина по п. 2.6.5.

Фракции, содержащие карбоксин, объединяют, выпаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.5. Рассчитывают содержание карбоксина в элюате, определяя полноту вымывания вещества из патрона и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: профиль вымывания карбоксина может меняться при использовании новой партии патронов Диапак С-16.

2.5.8. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6.1. Определение карбоксина в воде

Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 100 мл переносят в делительную воронку емкостью 250 мл и промывают дважды гексаном порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз в течение 2 - 3 минут и отбрасывая после расслаивания верхний органический слой. Затем добавляют к воде 100 мл 20%-ного раствора NaCl и экстрагируют карбоксин гексаном трижды порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз в течение 2 - 3 минут. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл гексана. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С.

Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ, и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Экстракция карбоксина из проб почвы, зерна и соломы пшеницы

Образец воздушно-сухой почвы, измельченной на ножевой мельнице соломы, массой 10 г или предварительно размолотого на зерновой мельнице зерна массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой, добавляют 50 мл 50%-ного водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (45 - 50 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С, фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "синяя лента". Объем раствора доводят до 50 мл, дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.3.

2.6.3. Очистка экстрактов на патроне Диапак С-16

Полученный по п. 2.6.2 раствор количественно переносят в подготовленный по п. 2.5.6 патрон Диапак С-16. Колбу обмывают еще 10 мл дистиллированной воды и также переносят на патрон <*>. Элюат отбрасывают. Карбоксин элюируют 50 мл элюента. Ацетон упаривают до водного остатка (35 - 40 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.4.

2.6.4. Очистка экстрактов

Объем водного остатка доводят до 50 мл, переносят в делительную воронку объемом 250 мл и промывают дважды гексаном порциями по 10 мл, встряхивая каждый раз в течение 2 - 3 минут и отбрасывая после расслаивания верхний гексановый слой. Затем добавляют 100 мл 20%-ного раствора NaCl, и карбоксин экстрагируют гексаном трижды по 50 мл, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 - 3 мин. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл гексана. Полученный раствор выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С.

Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ, и 50 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки, или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка Symmetry - С18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA).

Температура колонки 25 +/- 1 °С.

Предколонка Waters Symmetry С-18 (20 х 3,9) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA), для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 45:55 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 250 нм.

Объем вводимой пробы 50 мкл.

Время удерживания карбоксина 9,8 +/- 0,2 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,00 мкг/мл.

2.6.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание карбоксина в образце воды, почвы или растительных материалов (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств карбоксина в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбоксина 2 мкг/мл, разбавляют.

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости результатов измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.