"МУК 4.1.1907-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств тебуконазола в зерне и соломе риса, ягодах и соке винограда методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 01.01.2004)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Байер КропСайенс АГ (Германия).

Торговое название: Фалькон.

Действующее вещество: тебуконазол.

(RS)-1-п-хлорфенил-4,4-диметил-3-(1H-1,2,4-триазол-1-илметил)пентан-3-ол (ИЮПАК).

(+/-)-альфа-[2-(4-хлорфенил)этил]-альфа-(1,1-диметилэтил)-1H-1,2,4-триазол-1-этанол (С.А.).

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 307,8.

Существует в виде смеси рацематов.

Бесцветное кристаллическое вещество.

Температура плавления: 105 °С.

Растворимость (г/л) при 20 °С: дихлорметан - более 200, изопропанол, толуол - 50 - 100, гексан - менее 0,1, вода - 0,036.

Вещество устойчиво к гидролизу при pH 5 - 9 и фотолизу.

Тебуконазол медленно разрушается в почве и слабо передвигается по почвенному профилю.

Краткая токсикологическая характеристика:

Тебуконазол нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей и водорослей.

Гигиенические нормативы для тебуконазола в России: ОДК в почве - 0,4 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,025 мг/куб. дм; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,4 мг/куб. м; МДУ для зерна хлебных злаков - 0,2 мг/кг, ВМДУ для винограда - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата:

Тебуконазол - системный фунгицид широкого спектра действия. Эффективен против возбудителей мучнистой росы, ржавчины, септориоза, фузариоза, головни на зерновых злаках, серой гнили винограда, антракноза льна. Используется как для обработки вегетирующих растений, так и для протравливания семян. Иногда применяется в комбинациях с другими фунгицидами. Тебуконазол входит в состав комбинированного фунгицида Фалькон, КЭ, содержащего в 1 л препарата 250 г спироксамина, 167 г тебуконазола и 43 г триадименола. В настоящее время этот препарат проходит регистрационные испытания в России в качестве средства борьбы с пирикуляриозом риса и оидиумом винограда.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на газохроматографическом определении тебуконазола с ТИД на неподвижной фазе OV-17 после экстракции его из ягод ацетоном, из зерна и соломы водным ацетоном и из виноградного сока дихлорметаном, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании риса и винограда.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Тебуконазол с содержанием д.в. 97,4% (Байер, Германия).

Ацетон, ГОСТ 2603-79.

Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Метилен хлористый, ГОСТ 19433-88.

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Толуол, ГОСТ 5789-78.

Этилацетат, ГОСТ 22300-76.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (2:8, по объему).

Азот газообразный, о.с.ч., ГОСТ 9293-74.

Водород, получаемый из генератора водорода, ГОСТ 3023-80.

Воздух из баллона, ГОСТ 9010-80.

Силикагель (0,063 - 0,2 мм) для адсорбционной хроматографии (Мерк, Германия) I степени активности.

Стекловата.

Фильтры бумажные синяя лента, ТУ 6-09-1678.

Колонка хроматографическая набивная стеклянная, 2000 х 3 мм, неподвижная фаза - 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,12 - 0,15 мм).

Колонка капиллярная ZB-1, 30 м х 0,32 мм х 0,5 мкм, неподвижная фаза SE-30, фирма Phenomenex, США, или аналогичная.

Микрошприц емкостью 10 мкл МШ-10Ф по ТУ 64-1-2850.

Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74.

Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75.

Встряхиватель механический, ТУ 64-1-1081-73.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Колонка для адсорбционной хроматографии, 25 х 1,8 см.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79, или аналогичная.

Ротационный испаритель, тип ИР-1М, ТУ 25-11.

Воронка Бюхнера, ГОСТ 9147-73.

Воронки делительные вместимостью 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100 и 250 мл, ГОСТ 9737-70.

Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 мл, ГОСТ 1770-74.

Колбы грушевидные вместимостью 100 и 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74Е.

Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 и 10 мл, ГОСТ 10515-75.

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 1770-74.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Зерно и солому риса подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре. Виноград хранят в стеклянной посуде в холодильнике при температуре не выше +4 °С не более двух дней; при длительном хранении (не более трех месяцев) пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С. Перед анализом зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице, а ягоды измельчают.

2.5.1. Подготовка и кондиционирование колонки

Готовую насадку (3% OV-17 на Хромосорбе W/HP) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 270 °С в течение 8 - 10 часов.

Капиллярную колонку с фазой ZB-1 устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 280 °С в течение 8 - 10 часов.

2.5.2. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Силикагель I степени активности встряхивают с двойным объемом очищенного ацетона и затем фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Силикагель на фильтре промывают 1,5 объемом ацетона и затем высушивают при температуре 130 °С в течение 3 часов.

2.5.3. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор тебуконазола с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,0103 г препарата, содержащего 97,4% д.в., в ацетоне в мерной колбе емкостью 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора тебуконазола соответствующим последовательным разбавлением ацетоном. Рабочие растворы хранят в холодильнике не более недели.

2.5.4. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора тебуконазола с концентрацией 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ х с от концентрации тебуконазола в растворе в мкг/мл.

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 3 г силикагеля в 10 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 25 мл смеси гексан - этилацетат (2:8, по объему) и 20 мл гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова для работы.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения тебуконазола на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора тебуконазола с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл гексана и наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл смеси гексан - этилацетат (1:1, по объему), затем 60 мл элюента N 1 (гексан - этилацетат, 2:8) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл толуола и анализируют на содержание тебуконазола по п. 2.7.

Фракции, содержащие тебуконазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 4 мл толуола и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание тебуконазола в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: Профиль вымывания тебуконазола может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6.1. Экстракция тебуконазола

2.6.1.1. Зерно, солома. К навеске размолотого зерна (10 г) или соломы (5 г) добавляют 100 мл 70%-ного водного ацетона и суспензию перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл указанного выше водного ацетона. Из объединенного экстракта отбирают половину объема (около 70 мл) раствора, эквивалентного 5 г зерна или 2,5 г соломы. Дальнейшую очистку проводят по п. п. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.2. Ягоды. К навеске (20 г) измельченного материала добавляют 100 мл ацетона и гомогенизируют 3 минуты при 10000 об./мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл ацетона. Из объединенного ацетонового экстракта отбирают половину объема (около 75 мл) раствора, эквивалентного 10 г ягод. Дальнейшую очистку проводят по п. п. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.3. Сок. К 10 мл свежевыжатого сока добавляют 20 мл насыщенного раствора хлорида натрия и содержимое переносят в делительную воронку емкостью 100 мл. В воронку добавляют 30 мл хлористого метилена и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а водную фазу обрабатывают хлористым метиленом еще два раза (30 + 20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 5 мл толуола и анализируют на содержание тебуконазола по п. 2.7.

2.6.2. Очистка экстракта

Отобранные аликвоты растительного экстракта (из п. п. 2.6.1.1 и 2.6.1.2) упаривают до водной фазы (объем 5 - 15 мл) на роторном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 20 мл насыщенного раствора хлорида натрия, 30 мл хлористого метилена и смесь встряхивают в течение 1 минуты. После разделения слоев собирают органическую фракцию, а водную фазу обрабатывают хлористым метиленом еще два раза (30 + 20 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С.

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов растительного материала, количественно переносят тремя 1-мл порциями смеси гексан - этилацетат (8:2) в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Колонку промывают 40 мл смеси гексан - этилацетат (1:1, по объему), которые отбрасывают. Тебуконазол элюируют 50 мл элюента N 1 (гексан - этилацетат, 2:8) и элюат собирают в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток экстрактов зерна и соломы растворяют в 2,5 мл экстракта ягод, в 5 мл толуола и анализируют на содержание тебуконазола по п. 2.7.

2.7.1. Метод ГЖХ с насадочными колонками

Колонка стеклянная спиральная 1000 х 3 мм; неподвижная фаза - 3% OV-17 на Хромосорбе W/HP (0,125 - 0,150 мм).

Температура детектора 330 °С, инжектора 270 °С, термостата колонки 245 °С.

Скорость потока газа-носителя (азота) - 30 мл/мин., водорода - 10,8 мл/мин., воздуха - 200 мл/мин.

Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Время удерживания тебуконазола: 3 мин. 20 сек.

Линейный диапазон детектирования: 0,2 - 2 нг.

Альтернативная неподвижная фаза: 3% OV-61 на Хромосорбе W/HP (0,16 - 0,20 мм); колонка стеклянная 1000 х 3 мм; температура колонки - 230 °С, испарителя - 270 °С, детектора - 330 °С.

Время удерживания тебуконазола: 2 мин. 34 сек.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю площадь хроматографического пика тебуконазола.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 1,0 мкг/мл, разбавляют толуолом.

2.7.2. Метод ГЖХ с капиллярными колонками

Хроматограф газовый "Кристалл 2000М" с термоионным детектором.

Колонка капиллярная кварцевая ZB-1, 30 м х 0,32 мм х 0,5 мкм (SE-30).

Температура термостата колонки программированная: начальная температура - 160 °С, выдержка 1 минуту; нагрев колонки по 25°/мин. до температуры 240 °С, выдержка 0 минут; нагрев колонки по 4°/мин. до температуры 265 °С, выдержка 5 минут; нагрев колонки по 25°/мин. до температуры 280 °С, выдержка 5 минут. Температура термостата испарителя - 270 °С, детектора - 330 °С.

Газовый режим: газ-носитель - азот, общий расход - 22,7 мл/мин.; газ для поддува в детектор - азот, расход - 20 мл/мин. Расход водорода - 11,8 мл/мин., воздуха - 200 мл/мин.

Деление потока: 1:2.

Абсолютное время удерживания тебуконазола: 10 мин. 36 сек.

Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 - 1,5 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю площадь хроматографического пика тебуконазола.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют толуолом.

Содержание тебуконазола рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

ВНИИ фитопатологии.