"МУК 4.1.1429-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Десмедифама в воде, почве, корнеплодах и зеленой массе сахарной, столовой и кормовой свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Минздравом России 24.06.2003)

1. Методические указания подготовлены: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. Довгилевич А.В.); при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов). Разработчики методики указаны в конце.

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Авентис КропСайенс.

Торговое название: Бетанал АМ, Бетана Прогресс Ам.

Название действующего вещества по ИСО: Десмедифам.

Название действующего вещества по ИЮПАК: Этил-3-фенилкарбамоилоксифенилкарбамат; этил-3-фенилкарбамоилоксикарбанилат; 3-этоксикарбониламинофенил фенилкарбамат.

Растворимость в воде - 7 мг/л (при 20 °С).

Растворимость в органических растворителях (г/л при 20 °С): ацетон - 400,0; метанол - 180,0; толуол - 4,2; этилацетат - 149,0; хлороформ - 80,0; дихлорэтан - 17,8; бензол - 1,6; толуол - 1,2; гексан - 0,5.

Стабилен в течение 2 лет при 70 °С. Стабилен в кислой водной среде, гидролизуется в нейтральной и щелочной средах. Время полуразложения в водном растворе при рН 3,8 на свету составляет 224 часа. Гидролизуется наполовину при рН 5 - 70 дней, при рН 7 - 20 часов, при рН 9 - 10 мин.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД (мг/кг/сут.) - 0,025;

ПДК в воде водоемов (мг/л) - 0,05;

ПДК в почве (мг/кг) - 0,25;

ПДК в воздухе рабочей зоны (мг/куб. м) - 1,0;

ВМДУ в столовой свекле (мг/кг) - 0,1.

Область применения препарата

Десмедифам - узко избирательный системный гербицид, проникающий в растения через листья и подавляющий процесс передачи электронов при фотосинтезе. Подавляет развитие широколистных сорняков, включая щирицу запрокинутую, в посевах свеклы. Особенно эффективен в стадии проростков сорных растений. Его действие не зависит от типа почвы и влажности. Используется, в основном, как компонент смесей с Фенмедифамом и Этофумезатом.

В России и странах СНГ зарегистрированы препараты: Бетанал С, Бетанал АМ 11, Бетанал Прогресс АМ и Бетанал Прогресс ОФ - в качестве гербицидов в посевах сахарной и кормовой свеклы с нормой расхода 1 - 6 л/га по препарату (70 - 480 г Десмедифама на га) при одно-, трехкратной обработках в фазу от 2 настоящих листьев культуры.

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании сахарной, столовой и кормовой свеклы.

--------------------------------

<*> Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцово-кислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.

Перед началом эксперимента проверяют чистоту гексана, этилацетата и хлористого метилена. Для этого досуха упаривают на ротационном вакуумном испарителе 100 мл растворителя, добавляют в концентратор 2 мл ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют при 235 нм. При недостаточной чистоте растворителей проводят их очистку.

Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором марганцово-кислого калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976, 441 с.).

Хлористый метилен встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают водным раствором карбоната натрия, водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют над оксидом (V) фосфора (Гордон А., Форд Р. Спутник химика. М., 1976, 440 с.).

Этиловый эфир уксусной кислоты промывают равным объемом 5% раствора соды, сушат над безводным хлористым кальцием (Беккер Г. и др. Органикум. М., 1979, 372 с.), кипятят в течение 1 часа с прокаленным сульфатом магния и затем перегоняют.

Колонку Zorbax SB-C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин. в течение 3 - 4 часов.

2.3.2.1. Приготовление 2 н раствора ортофосфорной кислоты.

В мерную колбу объемом 100 мл наливают 50 мл очищенной воды, добавляют 13,8 мл концентрированной ортофосфорной кислоты, перемешивают, доводят до метки очищенной водой и тщательно перемешивают.

2.3.2.2. Приготовление фазы для растворения образцов и последовательного разведения стандартных растворов.

В колбу объемом 100 мл помещают 50 мл ацетонитрила, добавляют 50 мл очищенной воды и 2 капли 2 н ортофосфорной кислоты, тщательно перемешивают. Фазу используют для растворения стандартов, образцов и последовательного разведения стандартных растворов.

2.3.2.3. Приготовление стандартных растворов.

Взвешивают 10 мг Десмедифама в мерной колбе объемом 100 мл. Навеску растворяют в 100 мл смеси растворителей для растворения стандартов (ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 с добавлением 2 капель 2 н ортофосфорной кислоты на 100 мл смеси) (стандартный раствор с концентрацией Десмедифама 100 мг/мл). Затем 10,0 мл стандартного раствора с концентрацией 100,0 мкг/мл отбирают пипеткой в мерную колбу объемом 100 мл и доводят объем до метки смесью растворителей для растворения стандартов при перемешивании (стандартный раствор с концентрацией Десмедифама 10,0 мкг/мл). Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/мл Десмедифама, и используют эти растворы для хроматографического исследования и внесения в контрольные образцы. Стандартные растворы можно хранить в холодильнике в течение трех месяцев.

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 450 мл ацетонитрила и 500 мл очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 мл/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин. Полученный раствор используют в качестве подвижной фазы.

Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно 3 раза по 20 мкл каждого из стандартных растворов, содержащих Десмедифам с концентрациями 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/мл, измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят график зависимости площади пика от концентрации Десмедифама.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 2 мл/мин.

2.3.5.1. Кондиционирование патрона.

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 5 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и 10 мл воды. Элюат отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!

Из стандартного раствора Десмедифама, содержащего 1 мкг/мл, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 8 мл воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор наносят на патрон. Концентратор тщательно обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:4 и смесь также вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл смеси для растворения образцов, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют для проверки наличия в нем Десмедифама (анализируемое вещество должно остаться в колонке).

Десмедифам элюируют с патрона 15 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 порциями по 5 мл. Элюат после внесения каждой порции упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси для растворения образцов, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну, тщательно обмывают стенки концентратора и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Десмедифам, и объединяют их.

На основе полученных данных рассчитывают полноту снятия Десмедифама с патрона и количество элюата, необходимое для элюирования анализируемого вещества.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 2 мл/мин.

2.3.6.1. Кондиционирование патрона.

Патрон Диапак-С устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 10 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 1:1 и 10 мл смеси гексана. Элюат отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!

2.3.6.2. Проверка хроматографического поведения Десмедифама на концентрирующем патроне Диапак-С.

Из стандартного раствора Десмедифама, содержащего 1 мкг/мл, отбирают 1 мл, помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 8 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 мл, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл смеси для растворения и хроматографируют. Продолжают элюирование Десмедифама двумя порциями по 5 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 8:2. Элюат после внесения каждой порции растворителей собирают в концентратор, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл смеси для растворения образцов и хроматографируют.

На основе полученных данных рассчитывают полноту снятия Десмедифама с патрона и количество элюата, необходимое для элюирования анализируемого вещества.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы сахарной, столовой и кормовой свеклы замораживают и хранят при температуре -18 °С. Непосредственно перед определением пробы корнеплодов измельчают на терке. Пробы зеленой массы свеклы измельчают ножницами.

2.5.1.1. Экстракция.

Пробу воды объемом 200 мл фильтруют через фильтр "красная лента" в делительную воронку емкостью 500 мл, добавляют 50 мл хлористого метилена и интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой хлористого метилена собирают в концентратор, пропуская экстракт через безводный сульфат натрия. Экстракцию Десмедифама хлористым метиленом повторяют еще 2 раза порциями по 50 мл, интенсивно встряхивая воронку в течение 2 мин. Каждый раз после разделения фаз в воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор, пропуская экстракт через безводный сульфат натрия. Осушитель обмывают 10 мл хлористого метилена и смыв объединяют с основным экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Пропускают раствор через патрон со скоростью не более 2 мл/мин. Элюат отбрасывают. Концентратор тщательно обмывают 10 мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:4 и смесь также вносят на патрон. Элюат также отбрасывают. Десмедифам элюируют с патрона 10-ю мл смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1. Элюат собирают в концентратор и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 8 мл смеси для растворения образцов и аликвоту объемом 20 мкл вводят в хроматограф.

2.5.2.1. Экстракция и предварительная очистка.

Образец почвы массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл. Прибавляют 10 мл 0,1 н соляной кислоты, встряхивают до полного смешивания и выдерживают 10 мин. при комнатной температуре. Затем добавляют 50 мл ацетонитрила и экстрагируют Десмедифам в течение 10 мин. на ультразвуковой ванне. Колбу дополнительно встряхивают в течение 5 мин. на механическом встряхивателе. Экстракт переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2500 об./мин. 5 мин. Супернатант фильтруют в концентратор объемом 250 мл через фильтр "красная лента".

Экстракцию повторяют еще два раза, добавляя каждый раз по 50 мл смеси ацетонитрил-0,1 н соляная кислота в соотношении 9:1, выдерживая по 10 мин. на ультразвуковой ванне и встряхивая дополнительно 5 мин. на механическом встряхивателе. После центрифугирования экстракт фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" в тот же концентратор.

К объединенному экстракту в концентраторе добавляют 5 мл дистиллированной воды и упаривают экстракт на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка. К водному остатку добавляют 5 мл смеси для растворения образцов и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в тот же концентратор добавляют 50 мл воды, 20 мл насыщенного раствора поваренной соли, содержимое концентратора перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 мл. Концентратор обмывают 30 мл хлористого метилена, растворитель переносят в ту же делительную воронку и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой хлористого метилена собирают в концентратор через слой безводного сульфата натрия.

Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 30 мл хлористого метилена и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. Экстракты (нижний слой) объединяют в концентраторе, осушитель обмывают 10 мл хлористого метилена, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют в концентратор 50 мл гексана, перемешивают и переносят содержимое концентратора в сухую (!) делительную воронку. Туда же добавляют 20 мл ацетонитрила и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 100 мл. Экстракцию ацетонитрилом повторяют еще 2 раза порциями по 20 мл. Ацетонитрильные экстракты объединяют и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

2.5.2.2. Очистка экстракта на патронах.

После очистки элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата, помещают на 30 с в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 8 мл гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Концентратор тщательно обмывают 5 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 8:2 и смесь также вносят на патрон. Элюат собирают и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 5 - 10 мл смеси для растворения образцов и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.

Образец измельченных корнеплодов массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют последовательно 0,1 мл концентрированной соляной кислоты, 50 мл этилацетата и экстрагируют Десмедифам в течение 10 мин. на ультразвуковой ванне. Колбу дополнительно встряхивают в течение 5 мин. на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют в концентратор через бумажный фильтр "красная лента".

Экстракцию повторяют еще два раза, добавляя каждый раз по 50 мл ацетонитрила, выдерживая по 10 мин. на ультразвуковой ванне и встряхивая дополнительно 5 мин. на механическом встряхивателе. Экстракты фильтруют и объединяют в концентраторе, добавляют 5 мл дистиллированной воды и упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка.

К водному остатку добавляют 5 мл смеси для растворения образцов и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в тот же концентратор добавляют 30 мл воды, 10 мл насыщенного раствора поваренной соли, перемешивают содержимое и переносят его из концентратора в делительную воронку объемом 250 мл. Концентратор обмывают 30 мл хлористого метилена, помещают его в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой хлористого метилена собирают в концентратор через слой безводного сульфата натрия.

Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 30 мл хлористого метилена и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. В случае образования эмульсии при третьей экстракции хлористым метиленом к содержимому делительной воронки необходимо добавить 100 мл дистиллированной воды, перемешать (не встряхивать!) и дождаться полного разделения слоев. Экстракты (нижний слой) объединяют в концентраторе, осушитель обмывают 10 мл хлористого метилена, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

После очистки элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 5 мл смеси для растворения образцов и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.

Образец измельченной зеленой массы массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют последовательно 0,1 мл концентрированной соляной кислоты, 50 мл этилацетата и экстрагируют Десмедифам в течение 10 мин. на ультразвуковой ванне. Колбу дополнительно встряхивают в течение 5 мин. на механическом встряхивателе. Экстракт фильтруют в концентратор через бумажный фильтр "красная лента".

Экстракцию повторяют еще два раза, добавляя каждый раз по 0,1 мл концентрированной соляной кислоты и 50 мл ацетонитрила, выдерживая по 10 мин. на ультразвуковой ванне и встряхивая дополнительно 5 мин. на механическом встряхивателе. Экстракты фильтруют и объединяют в концентраторе, добавляют 5 мл дистиллированной воды и упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка.

К водному остатку добавляют 5 мл смеси для растворения образцов и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в тот же концентратор добавляют 30 мл воды, 10 мл насыщенного раствора поваренной соли, перемешивают и переносят содержимое концентратора в делительную воронку объемом 250 мл. Концентратор обмывают 30 мл хлористого метилена, помещают его в ту же делительную воронку и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой хлористого метилена собирают в концентратор через слой безводного сульфата натрия.

Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 30 мл хлористого метилена и интенсивно встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. Для полного разделения водного слоя и слоя хлористого метилена дают выстояться содержимому делительной воронки после встряхивания 5 - 7 мин. В случае образования эмульсии при третьей экстракции хлористым метиленом к содержимому делительной воронки необходимо добавить 100 мл дистиллированной воды, перемешать (не встряхивать!) и дождаться полного разделения слоев. Экстракты (нижний слой) объединяют в концентраторе, осушитель обмывают 10 мл хлористого метилена, объединяют с основным экстрактом и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 2 мл этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют в концентратор 50 мл гексана, перемешивают и переносят содержимое концентратора в сухую (!) делительную воронку. Туда же добавляют 20 мл ацетонитрила и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 100 мл. Экстракцию ацетонитрилом повторяют еще 2 раза порциями по 20 мл. Ацетонитрильные экстракты объединяют и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

После очистки на патронах элюат упаривают досуха, растворяют в 5 мл смеси для растворения образцов и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.

Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.

Колонка стальная Zorbax SB-C18, 4,6 мм х 25 см, зернением 5 мкм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Промывка колонки после выхода Десмедифама в течение 15 мин. Общее время хроматографирования одной пробы - 30 мин.

Содержание Десмедифама рассчитывают по формуле:

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

Калинин В.А., проф., к.с-х.н., Довгилевич Е.В., к. биол. н., Довгилевич А.В., к. хим. н., Устименко Н.В., к. биол. н.

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1. Телефон: (095) 976-37-68, факс: (095) 976-43-26.