"МУК 4.1.1426-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Беномила по карбендазиму и Карбендазима в воде, почве, семенах рапса (горчицы) и подсолнечника, клубнях картофеля, корнеплодах сахарной свеклы, яблоках, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Минздравом России 24.06.2003)

1. Методические указания подготовлены: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. Довгилевич А.В.); при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов). Разработчики методики указаны в конце.

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

4. Введены впервые.

1.1. Фирма-производитель: Агро-Кеми защита растений, Дюпон де Немур.

Торговое название: Фундазол, Бенлат.

Название действующего вещества по ИСО: Беномил.

Название действующего вещества по ИЮПАК: Метил 1-(бутилкарбомоил)бензимидазол-2-илкарбамат.

Растворимость в воде при 24 °С - 3,6 мкг/л (рН 5), 2,9 мг/л (рН 7), 1,9 мг/л (рН 9). Растворимость в органических растворителях (г/кг при 25 °С): диметилформамид - 53, ацетон - 18, этанол - 4, хлороформ - 94, гептан - 0,4.

Беномил разрушается сильными кислотами и щелочами, в некоторых растворителях диссоциирует до Карбендазима и бутилизоцианата. В водных растворах, во влажной почве, в присутствии воды при хранении быстро разлагается. Стабилен при хранении при температуре ниже 50 °С в отсутствии света и влаги.

Остаточные количества в семенах и масле сои, ягодах земляники, смородины, винограда, во фруктах и овощах не допускаются.

Область применения препарата. Беномил - фунгицид системного действия с длительным защитным эффектом из группы производных бензимидазола, эффективно подавляет развитие широкого круга заболеваний растений, вызываемых грибами из классов аскомицетов, базидиомицетов и несовершенных грибов на зерновых и овощных культурах, сахарной свекле, виноградниках, в садах при норме расхода 140 - 550 г д.в./га и 0,6 - 1,0 кг д.в./т при обработке семян. Препараты на основе Беномила широко применяются для защиты овощей и фруктов при хранении и транспортировке. Они зарегистрированы в России и странах СНГ под торговыми названиями Фундазол, 500 г/кг СП и Беномил, 500 г/кг СП для применения на зерновых культурах, рисе, сое, льне-долгунце, сахарной свекле, на плантациях винограда, плодовых и ягодных, цветочных и декоративных культур с нормой расхода препарата от 0,3 - 3 л/га (до 3-х обработок за сезон), а также для обработки семян зерновых и зернобобовых культур, проса, рапса и риса при норме расхода 1,5 - 2,5 кг/т.

Препарат Фундазол проходит перерегистрацию в России.

1.2. Фирма-производитель: Агро-Кеми защита растений.

Торговое название: Колфуго.

Название действующего вещества по ИСО: Карбендазим.

Название действующего вещества по ИЮПАК: Метилбензимидазол-2-илкарбамат.

Остаточные количества в ягодах земляники, смородины, винограда, яблоках и огурцах не допускаются.

Область применения препарата. Карбендазим - фунгицид системного действия с длительным защитным эффектом из группы производных бензимидазола, эффективно подавляет развитие заболеваний растений, вызываемых грибами из родов Septoria, Fusarium, Erysiphe, Tilletia, Ustilago и Pseudocercosporella на зерновых культурах, Cercospora и Erysiphe на сахарной свекле, Uncinula и Botrytis на виноградниках при норме расхода 120 - 600 г д.в./га и 0,6 - 0,8 кг/т при обработке семян. Зарегистрирован в России и странах СНГ под торговыми названиями Колфуго Супер, 200 г/л ВС для применения на зерновых культурах, сахарной свекле, на плантациях плодовых культур с нормой расхода препарата от 0,3 - 2 л/га (до 3 обработок за сезон), а также Колфуго Супер Колор, 200 г/л ВС для обработки семян зерновых и зернобобовых культур, проса, рапса и риса при норме расхода 1,5 - 2,5 кг/т.

Карбендазим широко используется для приготовления смесевых препаратов.

Методика основана на определении Беномила в виде Карбендазима и Карбендазима методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после их экстракции (с одновременным гидролизом Беномила до Карбендазима) из образцов органическим растворителем, очистки путем перераспределения между двумя несмешивающимися фазами. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.

2.1.2.1. Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.

В прилагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании масличных и зерновых культур, яблок, картофеля и сахарной свеклы.

--------------------------------

<*> Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцово-кислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.

<**> Этиловый эфир уксусной кислоты кипятят в течение 1 часа с прокаленным сульфатом магния, добавленным из расчета 20 - 25 г/л, и затем перегоняют.

Колонку Symmetry Shield RP8, Symmetry Shield RP18 или Zorbax SB-C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при t° = 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин. в течение 3 - 4 часов.

Взвешивают 20 мг Карбендазима в мерной колбе объемом 100 мл. Навеску растворяют в метаноле (в ультразвуковой ванне) и доводят объем до метки ацетонитрилом (стандартный раствор N 1, концентрация Карбендазима - 200 мкг/мл). Затем 10 мл стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой в мерную колбу объемом 100 мл и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании (стандартный раствор N 2, концентрация Карбендазима - 20 мкг/мл). Стандартные растворы N 1 и 2 можно хранить в холодильнике в течение 3-х и 1-го месяцев соответственно. Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 10,0; 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 мкг/мл вещества, и используют эти растворы для построения калибровочного графика и внесения в контрольный образец при отработке методики.

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 300 мл ацетонитрила и 700 мл воды (для проведения анализов на колонке Symmetry Shield RP8 и Symmetry Shield RP18) и 250 мл ацетонитрила и 700 мл воды (для проведения анализов на колонке Zorbax SB-C18). Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 мл/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин. Полученный раствор используют в качестве подвижной фазы.

Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно 3 раза по 20 мкл каждого из полученных четырех растворов (с концентрацией Карбендазима 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 мкг/мл). Измеряют площади пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят график зависимости площади пика от концентрации Карбендазима (мкг/мл).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре. Пробы клубней картофеля, плодов яблок, корнеплодов сахарной свеклы замораживают и хранят при температуре -18 °С. Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, семена рапса и горчицы измельчают на лабораторной мельнице.

Пробу воды объемом 100 мл помещают в делительную воронку емкостью 250 мл, добавляют 2,0 мл 2% водного раствора гидроксида калия (до рН 10) и экстрагируют 30 мл этилацетата, встряхивая воронку в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний органический слой сливают в химический стакан. Нижний водный слой возвращают в делительную воронку, проверяют рН водной фазы, при необходимости доводят 2% водным раствором гидроксида калия до рН 10 и повторяют экстракцию этилацетатом еще 2 раза порциями по 30 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. (при этом рН водной фазы всегда должен быть не менее 10). Этилацетатный экстракт объединяют в химическом стакане, после чего переносят в делительную воронку и выделившийся водный (нижний) слой отбрасывают. Этилацетат собирают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия, осушитель обмывают еще 10 мл этилацетата, которые объединяют с экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Остаток растворителя отдувают холодным воздухом до полного исчезновения запаха этилацетата.

Сухой остаток растворяют в 10 - 25 мл ацетонитрила и 20 мкл раствора вводят в хроматограф.

Образец почвы массой 20 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, добавляют 10 мл дистиллированной воды, встряхивают колбу до полного смешивания и дают выстояться в течение 10 мин. Затем в колбу прибавляют 50 мл этилацетата и встряхивают на механическом встряхивателе в течение 30 мин. Экстракт переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2500 об./мин. 5 мин. Супернатант фильтруют в делительную воронку объемом 250 мл через фильтр "красная лента". Карбендазим экстрагируют еще 2 раза, используя по 50 мл этилацетата в течение 30 мин. с обязательным последующим центрифугированием. Экстракты объединяют в делительной воронке объемом 250 мл. Верхний этилацетатный слой оставляют в воронке, выделившийся нижний водный - отбрасывают. Из объединенного экстракта Карбендазим экстрагируют трижды, используя по 50 мл 0,1 н соляной кислоты, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний водный слой собирают в химический стакан объемом 200 мл, добавляют 10% гидроксида калия до рН 10 и экстрагируют 50 мл этилацетата, встряхивая воронку в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний этилацетатный слой сливают в химический стакан. Нижний водный слой возвращают в делительную воронку, проверяют рН водной фазы, доводят 10% раствором гидроксида калия до рН 10 и повторяют экстракцию этилацетатом еще 2 раза порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. (при этом рН водной фазы всегда должен быть не менее 10, добавляют 5 мл 10% гидроксида калия при каждой экстракции). Этилацетатный экстракт объединяют в химическом стакане, после чего переносят в делительную воронку и выделившийся водный (нижний) слой отбрасывают. Этилацетат собирают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия, осушитель обмывают еще 10 мл этилацетата, который объединяют с экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Остаток растворителя отдувают холодным воздухом до полного исчезновения запаха этилацетата. Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.

Образец размолотых семян массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 10 мл дистиллированной воды, встряхивают колбу до полного смешивания и дают выстояться в течение 10 мин. Затем в колбу прибавляют 50 мл этилацетата и встряхивают на механическом встряхивателе в течение 1 часа. Экстракт переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2500 об./мин. 5 мин. Супернатант фильтруют в колбу объемом 250 мл через фильтр "красная лента" и помещают в холодильник. Остаток после центрифугирования заливают 50 мл этилацетата, встряхивают на механическом встряхивателе в течение 15 мин. и оставляют на ночь при комнатной температуре. Утром смесь встряхивают в течение 15 мин. на механическом встряхивателе, экстракт переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2500 об./мин. 5 мин. Супернатант фильтруют через фильтр "красная лента" и объединяют с первым экстрактом в колбе. Карбендазим экстрагируют еще раз, используя 50 мл этилацетата в течение 30 мин. с обязательным последующим центрифугированием. Экстракты объединяют в делительной воронке объемом 500 мл. Выделившийся нижний водный слой отбрасывают. Из объединенного экстракта Карбендазим экстрагируют трижды, используя по 50 мл 0,1 н соляной кислоты, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. После полного разделения слоев нижний водный слой собирают и объединяют в химическом стакане объемом 200 мл, добавляют 50 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают.

К водному слою добавляют 50 мл гексана и операцию повторяют еще раз. Затем к водной фазе добавляют 10% водного раствора гидроксида калия до рН 10 и экстрагируют Карбендазим 50 мл этилацетата, встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний этилацетатный слой сливают в химический стакан. Нижний водный слой возвращают в делительную воронку, проверяют рН водной фазы, доводят 10% раствором гидроксида калия до рН 10 и повторяют экстракцию этилацетатом еще 2 раза порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. (при этом рН водной фазы всегда должен быть не менее 10, добавляют 5 мл 10% гидроксида калия при каждой экстракции). Этилацетатный экстракт объединяют в химическом стакане, после чего переносят в делительную воронку и выделившийся водный (нижний) слой отбрасывают.

Из объединенного этилацетатного экстракта Карбендазим реэкстрагируют трижды, используя по 30 мл 0,1 н соляной кислоты, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. Каждый раз после полного разделения слоев нижний водный слой собирают в химический стакан объемом 200 мл, объединяя водную фазу. Этилацетатную фазу отбрасывают.

Переносят водную фракцию в делительную воронку, добавляют в нее 10% водного раствора гидроксида калия до рН 10 и экстрагируют Карбендазим 30 мл этилацетата, встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний этилацетатный слой сливают в химический стакан. Нижний водный слой возвращают в делительную воронку, проверяют рН водной фазы, при необходимости прибавляют 10% гидроксида калия до рН 10 и повторяют экстракцию этилацетатом еще 2 раза порциями по 30 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. (при этом рН водной фазы всегда должен быть не менее 10, добавляют 5 мл 10% гидроксида калия при каждой экстракции). Этилацетатный экстракт объединяют в химическом стакане, после чего переносят в делительную воронку и выделившийся водный (нижний) слой отбрасывают. Этилацетат собирают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия, осушитель обмывают еще 10 мл этилацетата и объединяют с экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Остаток растворителя отдувают холодным воздухом до полного исчезновения запаха этилацетата. Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.

Образец измельченных клубней картофеля массой 20 г (для плодов яблок навеска - 10 г) помещают в коническую колбу объемом 250 мл. Затем в колбу прибавляют 30 мл этилацетата и встряхивают на механическом встряхивателе в течение 0,5 часа. Экстракт фильтруют в колбу объемом 250 мл через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще 2 раза порциями по 30 мл этилацетата, встряхивая на механическом встряхивателе в течение 0,5 часа. Экстракты объединяют в делительной воронке объемом 250 мл.

Из объединенного экстракта Карбендазим экстрагируют трижды, используя по 30 мл 0,1 н соляной кислоты, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. После полного разделения слоев нижний водный слой собирают и объединяют в химическом стакане объемом 200 мл, переносят в делительную воронку, добавляют 50 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. К водному слою добавляют 50 мл гексана и операцию повторяют еще раз.

Затем к водной фазе добавляют 10% водного раствора гидроксида калия (до рН 10) и экстрагируют Карбендазим 30 мл этилацетата, встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний органический слой сливают в химический стакан. Нижний водный слой возвращают в делительную воронку, проверяют рН водной фазы, доводят 10% раствором гидроксида калия до рН 10 и повторяют экстракцию этилацетатом еще 2 раза порциями по 30 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. (при этом рН водной фазы всегда должен быть не менее 10, добавляют 5 мл 10% гидроксида калия при каждой экстракции). Этилацетатный экстракт объединяют в химическом стакане, после чего переносят в делительную воронку и выделившийся водный (нижний) слой отбрасывают.

Из объединенного экстракта Карбендазим экстрагируют трижды, используя по 30 мл 0,1 н соляной кислоты, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. После полного разделения слоев нижний водный слой собирают в химический стакан объемом 200 мл, добавляют 10% водного раствора гидроксида калия до рН 10 и реэкстрагируют вещество 30 мл этилацетата, встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний органический слой сливают в химический стакан. Нижний водный слой возвращают в делительную воронку, проверяют рН водной фазы, доводят 10% раствором гидроксида калия до рН 10 и повторяют экстракцию этилацетатом еще 2 раза порциями по 30 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. (при этом рН водной фазы всегда должен быть не менее 10, добавляют 5 мл 10% гидроксида калия при каждой экстракции). Этилацетатный экстракт объединяют в химическом стакане, после чего переносят в делительную воронку и выделившийся водный (нижний) слой отбрасывают. Этилацетат собирают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия, осушитель обмывают еще 10 мл этилацетата и объединяют с экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Остаток растворителя отдувают холодным воздухом до полного исчезновения запаха этилацетата. Сухой остаток растворяют в 2,5 (яблоки); 3 (сахарная свекла); 5 (картофель) мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.

Образец размолотого зерна массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 5 мл дистиллированной воды и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем в колбу прибавляют 50 мл этилацетата и встряхивают на механическом встряхивателе в течение 0,5 часа. Экстракт фильтруют в колбу объемом 250 мл через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще 2 раза порциями по 50 мл этилацетата, встряхивая на механическом встряхивателе в течение 0,5 часа. Экстракты объединяют в делительной воронке объемом 250 мл.

Из объединенного экстракта Карбендазим экстрагируют трижды, используя по 50 мл 0,1 н соляной кислоты, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. После полного разделения слоев нижний водный слой собирают и объединяют в химическом стакане объемом 200 мл, переносят в делительную воронку, добавляют 50 мл гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. К водному слою добавляют 50 мл гексана и операцию повторяют еще раз. Затем к водной фазе добавляют 10% водного раствора гидроксида калия (до рН 10) и экстрагируют Карбендазим 50 мл этилацетата, встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний органический слой сливают в химический стакан. Нижний водный слой возвращают в делительную воронку, проверяют рН водной фазы, доводят 10% раствором гидроксида калия до рН 10 (добавляют 5 мл 10% гидроксида калия) и повторяют экстракцию этилацетатом еще 2 раза порциями по 30 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. (при этом рН водной фазы всегда должен быть не менее 10, добавляют 5 мл 10% гидроксида калия при каждой экстракции). Этилацетатный экстракт объединяют в химическом стакане, после чего переносят в делительную воронку и выделившийся водный (нижний) слой отбрасывают.

Из объединенного экстракта Карбендазим экстрагируют трижды, используя по 30 мл 0,1 н соляной кислоты, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. После полного разделения слоев нижний водный слой собирают в химический стакан объемом 200 мл, добавляют 10% раствора гидроксида калия до рН 10 (добавляют 5 мл 10% гидроксида калия) и экстрагируют 30 мл этилацетата, встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. После разделения фаз в воронке верхний органический слой сливают в химический стакан. Нижний водный слой возвращают в делительную воронку, проверяют рН водной фазы, прибавляют 10% гидроксида калия до рН 10 и повторяют экстракцию этилацетатом еще 2 раза порциями по 30 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 2 мин. (при этом рН водной фазы всегда должен быть не менее 10, добавляют 5 мл 10% гидроксида калия при каждой экстракции).

Этилацетатный экстракт объединяют в химическом стакане, после чего переносят в делительную воронку и выделившийся водный (нижний) слой отбрасывают. Этилацетат собирают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия, осушитель обмывают еще 10 мл этилацетата и объединяют с экстрактом. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Остаток растворителя отдувают холодным воздухом до полного исчезновения запаха этилацетата. Сухой остаток растворяют в 2,5 (яблоки, солома); 3 (сахарная свекла); 5 (картофель, зерно) мл ацетонитрила и аликвоту 20 мкл вводят в хроматограф.

Образец размолотой соломы массой 5 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, прибавляют 5 мл дистиллированной воды и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем в колбу прибавляют 75 мл этилацетата и помещают на 10 мин. в ультразвуковую ванну, после чего дополнительно встряхивают на механическом встряхивателе в течение 5 мин. Экстракт фильтруют в колбу объемом 250 мл через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще 2 раза порциями по 50 мл этилацетата по 10 мин. в ультразвуковой ванне и дополнительно по 5 мин. на механическом встряхивателе. Экстракты объединяют в делительной воронке объемом 250 мл.

Далее поступают как указано в пункте 2.5.5. Зерно пшеницы, начиная со второго абзаца со слов: "Из объединенного экстракта Карбендазим экстрагируют трижды, используя по 50 мл 0,1 н соляной кислоты...".

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

Калинин В.А., проф., к.с-х.н., Довгилевич Е.В., к. биол. н., Довгилевич А.В., к. хим. н., Устименко Н.В., к. биол. н.

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1. Телефон: (095) 976-37-68, факс: (095) 976-43-26.