"МУК 4.2.1070-01. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma longibrachiatum TW-1 - продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Минздравом России 20.09.2001)

1. Разработаны к.м.н. В.И. Бобровым (ВНЦ по безопасности биологически активных веществ).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.

3. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма - Trichoderma longibrachiatum TW-1 - продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Продуцент бета-глюканазы Trichoderma longibrachiatum TW-1 относится к классу несовершенных грибов. Рост характерных колоний определяется на 5 - 6 сутки. На агаризованной среде СМ микроорганизм образует характерные колонии до 15 мм в диаметре с гладкой подошвой, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами белого и желтого цвета. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые. Оптимальная температура роста 28 - 30 °С.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 5000 кл./куб. м, 3 класс опасности, пометка А.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия) продуцента бета-глюканазы на поверхность плотной питательной среды СМ и подсчете выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат продукции бета-глюканазы на среде с окрашенной целлюлозой.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны соблюдают:

- правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;

- правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;

- требования, изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980);

- положения "Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

Для определения продуцента бета-глюканазы воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента, а прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки.

На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо.

После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

Метод предполагает учет количества колоний, выросших на 2 - 3 сутки после посева проб воздуха, по зонам просветления, которые являются результатом образования целлюлаз на срезах с окрашенной целлюлозой в присутствии повышенного количества глюкозы.

Существенным признаком промышленных мутантов рода Trichoderma является пониженная катаболическая репрессия по сравнению с дикими мутантами Trichoderma. В то время как у диких штаммов глюкоза в концентрациях выше 0,02 г/л практически полностью подавляет образование целлюлаз в глубинной культуре, у промышленных мутантов подавление образования целлюлаз начинается при концентрациях глюкозы выше 1 г/л.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметил-сульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28 - 30 °С на 2 дня и затем при температуре 44 °С на 18 ч для образования вокруг колоний зон просветления.

Количественный учет микробных клеток штамма-продуцента бета-глюканазы проводится методом подсчета зон просветления, образующихся вокруг колоний микроорганизма как результат продукции глюканазы на среде СМ с окрашенной целлюлозой.

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

где:

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

Результаты измерений оформляют протоколом по форме:

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).