"МУК 4.2.1067-01. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 - продуцента монензина в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Минздравом России 20.09.2001)

1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской А.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.

3. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 - продуцента монензина в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Микроорганизм Streptomyces cinnamonensis НИЦБ 109 является продуцентом антибиотика монензина. Штамм растет на различных агаризованных и жидких средах. Культура образует цепочки спор, обычно прямые или слегка извилистые, с гладкой оболочкой.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента монензина в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента монензина на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента монензина в воздухе рабочей зоны соблюдают:

- правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;

- правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;

- положения "Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

Для определения продуцента монензина воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3 - 6-е сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор одного из антибиотиков (левомицетин, линкомицин, цефалотин или другой, указанные в разделе 2) для подавления посторонней бактериальной микрофлоры и нистатина (10 мкг/мл) для подавления грибковой флоры, тщательно перемешивают и разливают по 10 - 15 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28 °С. Через 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

где:

X - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При этом пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 кв. см.

Составляем пропорцию:

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин оседает количество бактерий, содержащееся в 1,57 л воздуха.

Надо определить количество клеток в 1 куб. м воздуха. На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин. оседает количество микробов, содержащееся в 1,57 л воздуха, за Т мин. - 1,57 х Тл.

В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 куб. м воздуха содержится:

Пример: за 30 мин. седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Дата проведения анализа ________________________________

Место отбора пробы _____________________________________

Название лаборатории ___________________________________

Юридический адрес организации __________________________

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).