"МУК 4.2.1004-00. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В99-продуцента витамина В12 в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания"
(утв. Минздравом России 20.12.2000)

1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской А.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 20 декабря 2000 г.

3. Введены впервые.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТов 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 200 кл./куб. м.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТу 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2 - 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицетин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 28 °С. Через 48 - 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

где:

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода применяют следующий расчет концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин. - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 кв. см.

Составляем пропорцию:

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин. оседает 1,57 л воздуха.

Надо определить количество клеток в 1 куб. м воздуха.

На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин. оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин. - 1,57 х Т л.

В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 куб. м воздуха содержится:

Пример: за 30 мин. седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96. М., 1991. 693 с.

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. Методики выполнения измерений.

3. ГОСТ 17.2.4.02-81. Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ. М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.