"МУК 4.1.1457-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств крезоксим-метила в воде, почве, яблоках и его метаболита крезоксима в воде и почве газохроматографическим методом"
(утв. Минздравом России 24.06.2003)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина), Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к.х.н. А.В. Довгилевич) при участии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: БАСФ (Германия).

Торговое название: Строби.

Действующее вещество: крезоксим-метил (BAS 490 F)

(Е)-метил-2-метоксиимино-2-/2-(о-толилокси-метил)фенил/ацетат (ИЮПАК).

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 313,4.

Белое кристаллическое вещество со слабым запахом.

Температура плавления: 97,2 - 101,7 °С.

Краткая токсикологическая характеристика

Крезоксим-метил не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и сенсибилизирующими свойствами.

Крезоксим-метил нетоксичен для пчел, дождевых червей, полезных насекомых и птиц. Гигиенические регламенты применения крезоксим-метила: ОДК в почве - 0,2 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,01 мг/куб. дм; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 1 мг/куб. м; ВМДУ для яблок -0,1 мг/кг.

Основной метаболит крезоксим-метила: крезоксим (BF 490-1)

(Е)-2-метоксиимино-2-/2-(о-толилокси-метил)фенил/ацетат (ИЮПАК).

структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 299,3.

Белый порошок без запаха.

Другие физико-химические и токсикологические характеристики основного метаболита крезоксим-метила отсутствуют.

Область применения препарата

Крезоксим-метил - синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным, лечебным и искореняющим действием.

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Строби, ВДГ (500 г/кг) в яблоневых садах в качестве средства борьбы с возбудителями мучнистой росы, парши, пятнистостей и ржавчины с нормой расхода препарата 0,14 - 0,32 кг/га при трехкратной обработке (по розовому бутону, после опадения 75% лепестков и по мелким плодам).

Крезоксим-метил весьма лабильное вещество и при попадании в воду или почву быстро гидролизуется с образованием более устойчивого соединения - крезоксима (2-метоксиимино-2-/2-(о-толилокси-метил)фенил/ацетат или BF 490-1). В яблоках крезоксим-метил слабо метаболизируется.

2.1.1. Принцип методики

Методика основана на газохроматографическом определении крезоксим-метила и крезоксима (в виде метилового эфира) на неподвижной фазе OV-17 с использованием детектора постоянной скорости рекомбинации ионов (ДПР) или электронзахватного детектора (ДЭЗ) после экстракции препарата из воды гексаном, из почвы и яблок водным ацетоном, а метаболита из подкисленной воды хлористым метиленом и из почвы водным ацетоном при ультразвуковой обработке, предварительной очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, метилирования метаболита диазометаном до метилового эфира крезоксима и окончательной очистки экстрактов на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании яблоневых садов.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Крезоксим-метил, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9% (БАСФ, Германия).

Крезоксим (BF 490-1), аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,3% (БАСФ, Германия).

Ацетон, чда, ГОСТ 2603-79.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

Гексан, ч, ТУ 6-09-3375-78.

Калий углекислый, хч, ГОСТ 4221-76.

Калия гидроксид, ГОСТ 24363-80.

Калия перманганат, хч, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, хч, ГОСТ 4161-77.

Кислота серная, хч, ГОСТ 4204-77.

Кислота хлористоводородная, хч, ГОСТ 3118-77.

Натрия гидроксид, хч, ГОСТ 4328-77.

Натрия сульфат безводный, хч, ГОСТ 4166-76.

Натрий углекислый, хч, ГОСТ 83-63.

Натрия хлорид, хч, ГОСТ 4233-77.

N-метил-N-нитрозо-п-толуолсульфонамид (Мерк, Германия) или N-нитрозо-метилмочевина, ТУ 6-09-11-1643-82.

Спирт метиловый, хч, ГОСТ 6995-77.

Толуол, хч, ТУ 6-09-4305-76.

Хлористый метилен, ГОСТ 12794-80.

Этилацетат, ГОСТ 22300-76.

Эфир диэтиловый, ГОСТ 6562-74.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат, 95:5, по объему.

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат, 90:10, по объему.

Силикагель для адсорбционной хроматографии (Вельм, Германия) I степени активности или силикагель КСК (60 - 100 меш).

Стекловата.

Целит 535 (2 - 15 мкм) /Серва, Германия/ или аналогичный.

Фильтры бумажные, синяя лента, ТУ 6-09-1678.

Газовый хроматограф с детектором постоянной скорости рекомбинации ионов "Цвет-560" или хроматограф газовый с электронзахватным детектором "Кристалл 2000 М".

Колонка хроматографическая стеклянная, 2000 х 2 мм, неподвижная фаза - 3% OV-17 на Инертоне N-AW супер (0,16 - 0,20 мм).

Колонка хроматографическая стеклянная, 2000 х 2 мм, неподвижная фаза - 5% SE-30 на Инертоне N-AW-DMCS (0,16 - 0,20 мм).

Микрошприц емкостью 10 мкл МШ-10Ф по ТУ 64-1-2850.

Баня ультразвуковая, модель D-50, Branson Inst.Co., США, или другая аналогичного типа.

Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74.

Водоструйный насос, ГОСТ 10696-75.

Встряхиватель механический, ТУ 64-1-1081-73.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63, или аналогичный.

Иономер ЭВ-74, ГОСТ 22261-76, или аналогичный.

Прибор для перегонки при атмосферном давлении.

Ротационный испаритель тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76.

Сито с диаметром отверстий 1 мм.

Баня водяная, ТУ 46-22-603-75.

Воронка Бюхнера, ГОСТ 0147-73.

Воронки делительные вместимостью 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 9737-70.

Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные вместимостью 25, 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Колбы грушевидные вместимостью 20 и 100 мл, ГОСТ 25336-82.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл, ГОСТ 20292-74Е.

Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 и 10 мл, ГОСТ 10515-75.

Цилиндры мерные вместимостью 25, 50, 100, 250 и 500 мл, ГОСТ 1770-74.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы почвы и яблок хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 3 дней. Для длительного хранения пробы почвы доводят до воздушно-сухого состояния и хранят в холодильнике; пробы яблок хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 °С в течение 3 дней, при температуре -18 °С в течение месяца.

Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, а яблоки измельчают.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2,5%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Этилацетат промывают равным объемом 5%-ного раствора углекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Диэтиловый эфир (1 л) предварительно встряхивают с 20 мл свежеприготовленного раствора железного купороса (30 г сульфата железа в 55 мл воды с добавлением 1,5 г концентрированной серной кислоты). Затем диэтиловый эфир последовательно промывают 0,5%-ным раствором перманганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2. Подготовка и кондиционирование колонки

Готовую насадку (3% OV-17 на Инертоне N-AW супер) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 270 °С в течение 8 - 10 часов.

2.5.3. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор крезоксим-метила с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,9% д.в., в толуоле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие растворы с концентрациями 0,025, 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора крезоксим-метила соответствующим последовательным разбавлением толуолом. Рабочие растворы хранят в холодильнике не более трех дней.

При изучении полноты открывания крезоксим-метила в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.

Основной стандартный раствор метаболита крезоксима с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,3% д.в., в ацетоне в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Из основного стандартного раствора метаболита готовят разбавлением ацетоном рабочие растворы с концентрациями 0,1, 0,5 и 2,5 мкг/мл, которые хранят в холодильнике не более 10 дней. Рабочие растворы используются при изучении полноты открывания крезоксима в воде и почве. При расчете количества вводимого в матрицу метаболита учитывают соотношение молекулярных масс крезоксима и метилового эфира крезоксима.

2.5.4. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора крезоксим-метила с концентрацией 0,025, 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации крезоксим-метила в мкг/мл.

2.5.5. Приготовление раствора диазометана в эфире

(Рисунок прибора для получения диазометана не приводится.)

В круглодонной колбе на 100 мл растворяют 5 г N-метил-N-нитрозо-п-толуолсульфонамида в 16 мл смеси диэтилового эфира и метанола (1:1). Колбу присоединяют к холодильнику, нижний конец которого снабжен аллонжем с отводом, проходящим через резиновую пробку с отводом и погруженным в слой эфира (40 мл) на дне приемника. Приемник охлаждают смесью льда и соли. В капельницу помещают 15 мл 50%-ного раствора едкого калия.

Реакцию начинают добавлением в реакционный сосуд раствора едкого калия по каплям, избегая бурного вскипания реакционной массы. Об окончании реакции судят по прекращению выделения диазометана в диэтиловый эфир.

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,2 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и приливают около 10 мл гексана. Затем в колонку вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают последовательно 50 мл элюента N 2 и 30 мл элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.6.1. Экстракция крезоксим-метила и крезоксима и очистка экстракта

2.6.1.1. Вода. 100 мл предварительно отфильтрованной воды помещают в делительную воронку емкостью 250 мл, добавляют 20 мл гексана и встряхивают 1 мин. Верхний органический слой отделяют, собирая в грушевидную колбу на 100 мл. Водную фазу экстрагируют гексаном еще дважды порциями по 20 мл. Объединенную органическую фазу, содержащую крезоксим-метил, пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С. Остаток растворяют в 2 мл толуола и анализируют на содержание крезоксим-метила по п. 2.7.

Водную фазу, оставшуюся после экстракции гексаном, переносят в делительную воронку емкостью 250 мл, подкисляют 1 н HCl до рН 2 и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 20 мл. Объединенную органическую фазу, содержащую метаболит крезоксим, пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают небольшими порциями в 20-мл грушевидной колбе на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.2. Яблоки

К навеске (25 г) измельченного материала добавляют 100 мл смеси ацетон - вода (2:1, по объему), гомогенизируют 3 минуты при 10000 об./мин. и суспензию перемешивают в течение 20 мин. на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу на 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл смеси ацетон - вода (2:1, по объему). Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (15 мл), эквивалентную 2,5 г растительного материала, и упаривают ее до водной фазы на роторном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 15 мл гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин. и после ее расслоения отделяют гексановый слой, который пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию водной фракции гексаном повторяют еще два раза (по 15 мл). Объединенный гексановый экстракт, содержащий крезоксим-метил, выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

2.6.1.3. Почва. Навеску (25 г) воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон - вода (2:1, по объему) и помещают в ультразвуковую баню на 5 мин. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок на фильтре промывают 50 мл смеси ацетон - вода (2:1, по объему). Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (27 мл), эквивалентную 5 г почвы, и упаривают ее до водной фазы на роторном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 15 мл бидистиллированной воды и 15 мл гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин. и после ее расслоения отделяют гексановую фракцию, которую пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию водной фракции гексаном повторяют еще два раза (по 15 мл). Объединенный гексановый экстракт, содержащий крезоксим-метил, выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

Оставшуюся после обработки гексаном водную фазу подкисляют 1 н HCl до рН 2 и переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 10 мл хлористого метилена и воронку встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев отделяют дихлорметановую фракцию, которую пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 20 мл. Экстракцию водной фракции хлористым метиленом повторяют еще два раза (10 + 5 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт, содержащий метаболит крезоксим, выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пп. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.2. Метилирование

К сухим остаткам водного (из п. 2.6.1.1) и почвенного (из п. 2.6.1.3) экстрактов, содержащим метаболит крезоксим, приливают соответственно 2 и 3 мл эфирного раствора диазометана (из п. 2.5.5), перемешивают, закрывают колбочки пробками и оставляют стоять в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем растворы упаривают досуха током воздуха.

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов растительного материала и почвы (из 2.6.1.2 и 2.6.1.3) или метилированных по п. 2.6.2 экстрактов воды и почвы, количественно переносят тремя 1-мл порциями элюента N 1 в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 20 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Крезоксим-метил элюируют 50 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухие остатки экстрактов воды, почвы и яблок растворяют в 2 мл толуола и анализируют по п. 2.7.

Скорость движения ленты самописца - 25,4 см/час.

Колонка стеклянная, спиральная 2000 х 2 мм; неподвижная фаза - 3% OV-17 на Инертоне N-AW супер (0,16 - 0,20 мм).

Температура детектора 320 °С, инжектора - 280 °С, термостата колонки - 265 °С.

Скорость потока газа-носителя (азота) - 30 мл/мин.

Объем вводимой пробы - 2 мкл.

Время удерживания крезоксим-метила - 4 мин.

Предел детектирования - 0,1 нг.

Линейный диапазон детектирования - 0,1 - 1,0 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют толуолом.

Альтернативная фаза: 5% SE-30 на Инертоне N-AW DMCS (0,16 - 0,20 мм); колонка стеклянная 2000 х 2 мм; условия хроматографирования те же.

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

Дубовая Л.В., научн. сотр.; Талалакина Т.Н., научн. сотр.; Макеев А.М., зав. лаб., канд. биол. наук.

ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.