"МУК 4.1.1146-02. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фамоксадона в воде, почве, клубнях картофеля, зеленой массе, соломе и зерне зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Минздравом России)

1. Методические указания подготовлены: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. Довгилевич А.В.); Всероссийским НИИ фитопатологии (А.М. Макеев и др.); Всероссийским НИИ защиты растений (В.И. Долженко и др.); Санкт-Петербургским НИИ лесного хозяйства (Маслаков С.Е., Л.В. Григорьева и др.), при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России.

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Дюпон, США.

Торговое название: Танос.

Синонимы: JE-874.

Название действующего вещества по ИСО: Фамоксадон.

Название действующего вещества по IUPAC: 3-анилино-5-метил-5-(4-феноксифенил)-2,4-оксазолидиндион.

Структурная формула (не приводится).

Фамоксадон не стабилен в водных растворах. Гидролиз наблюдается в диапазоне pH 5 - 9, и время полураспада составляет 41 день, 2 дня и 93 минуты при pH 5,0; 7,0 и 9,0 соответственно. Период полураспада при фотолизе составляет 4,6 дня и 3,9 часа при pH 5 и 7,75 соответственно.

Краткая гигиеническая характеристика

В РФ установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,01 мг/кг массы человека;

ОДК в почве - 0,1 мг/кг;

ПДК в воде водоемов - 0,01 мг/куб. дм;

ВМДУ в картофеле - 0,05 мг/кг.

Область применения

Фамоксадон (JE-874) - фунгицид из группы оксазолидиндионов контактного действия с глубинным эффектом. Является ингибитором митохондриального дыхания, специфически связываясь с активным центром убихинол-цитохром С оксидоредуктазы. Используется в заводских смесях с цимоксанилом и флусилазолом в антирезистентных системах применения фунгицидов.

Высокоэффективен против возбудителей из класса оомицетов, в т.ч. против рас возбудителей, устойчивых к фениламидам. Зарегистрирован в России под названием Танос (DPX - КР 481), диспергируемые в воде гранулы, 50% (25% фамоксадона + 25% цимоксанила) на картофеле с нормой расхода 0,6 кг/га, трехкратная обработка за сезон, проходил испытания на огурцах открытого и закрытого грунта.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении фамоксадона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, концентрирования экстракта упариванием в вакууме и очистки на колонках с флоризилом. Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 - 2.

2.1.3. Избирательность метода

В прилагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании пшеницы.

2.2.1. Реактивы, материалы и растворы

--------------------------------

<*> Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцово-кислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.

2.2.2. Приборы и оборудование

2.3.1. Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

Колонку Zorbax SB C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при t° = 25 °C и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин. в течение 3 - 4 часов.

2.3.2. Приготовление стандартных растворов

Взвешивают 50 мг фамоксадона в мерной колбе объемом 50 мл. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом (стандартный раствор N 1, концентрация фамоксадона 1 мг/мл). Затем методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 мг/мл вещества, и используют эти растворы для построения калибровочного графика и фортификации образцов.

2.3.3. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и дистиллированную воду.

--------------------------------

<*> Для приготовления 3,1 мМ ортофосфорной кислоты прибавляют к 4 л воды 840 мкл концентрированной ортофосфорной кислоты.

2.3.4. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно по 5 раз по 20 мкл каждого из полученных четырех растворов, измеряют высоту или площадь пиков, рассчитывают среднее значение высоты пика или его площади для каждой концентрации и строят график зависимости высоты пика или площади от концентрации фамоксадона мкг/мл.

2.3.5. Подготовка колонки для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г флоризила, дезактивированного путем добавления 5% очищенной воды. Сверху на флоризил насыпают 1 г безводного сульфата натрия. Перед использованием колонку промывают 10 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 3:1, избыток растворителя с колонки удаляют путем продавливания воздуха. Затем колонку дополнительно промывают 10 мл гексана. Перед внесением образца колонку увлажняют 5 мл гексана.

Примечание. Для дезактивации вначале флоризил выдерживают в сушильном шкафу при температуре 120 °C в течение 4 часов, а затем при постоянном перемешивании в стеклянной колбе с притертой пробкой к 95 г флоризила (60 - 100 меш, Merck) добавляют постепенно 5 г очищенной воды.

2.3.6. Проверка хроматографического поведения фамоксадона на колонке

В круглодонную колбу объемом 50 мл вносят 1 мл стандартного раствора фамоксадона с концентрацией 1 мкг/мл и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилацетата, затем добавляют в колбу 5 мл гексана и полученную смесь вносят на колонку. Затем промывают колонку 15 мл смеси гексан-этилацетат 10:1 и элюат отбрасывают. Фамоксадон элюируют с колонки последовательно 6-ю порциями объемом 5 мл смеси гексана с этилацетатом в соотношении 3:1, каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 мл ацетонитрила и 20 мкл пробы вводят в хроматограф.

Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Хроматографическое поведение фамоксадона на колонке обязательно проверяют при отработке методики и каждый раз при использовании новой партии флоризила.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы зеленой массы пшеницы и клубней картофеля хранят в морозильной камере при температуре -18 °C. Для длительного хранения пробы почвы, соломы и зерна подсушивают при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице.

2.5.1. Вода

2.5.1.1. Экстракция. Пробу воды объемом 500 мл помещают в делительную воронку емкостью 1000 мл и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 1 - 2 мин. После разделения фаз в воронке нижний слой сливают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

2.5.1.2. Очистка экстракта на колонке. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилацетата, обмывая стенки концентратора, затем в концентратор прибавляют 5 мл гексана, тщательно перемешивают и полученную смесь вносят на колонку. Затем колонку промывают последовательно 15 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 10:1 и 10 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 3:1 и элюат отбрасывают. Фамоксадон элюируют с колонки 20 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 3:1, собирают в концентратор и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила и 20 мкл раствора вводят в хроматограф.

2.5.2. Почва

2.5.2.1. Экстракция. Образец почвы массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, добавляют 10 мл дистиллированной воды и дают выстояться в течение 10 минут. Затем в колбу прибавляют 30 мл смеси ацетонитрила с водой в соотношении 8:2 и встряхивают колбу на механическом встряхивателе в течение 30 мин. Экстракт переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2500 об./мин. 5 мин. Супернатант фильтруют в делительную воронку объемом 250 мл через фильтр "красная лента". Фамоксадон экстрагируют еще 2 раза, используя по 30 мл смеси ацетонитрил-вода 8:2, встряхивая в течение 0,5 часа. Экстракты объединяют и переносят в делительную воронку объемом 250 мл.

2.5.2.2. Предварительная очистка экстракта. К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 5 г хлорида натрия, интенсивно встряхивают и оставляют на 10 минут. По истечении этого времени и после разделения слоев в делительной воронке нижний водный слой с остатком нерастворившегося хлорида натрия отбрасывают. К оставшемуся в делительной воронке ацетонитрильному экстракту прибавляют 40 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетонитрила, добавляют в концентратор 50 мл дистиллированной воды и полученную смесь переносят в делительную воронку. Фамоксадон экстрагируют хлористым метиленом трижды, используя по 20 мл растворителя и интенсивно встряхивая смесь в течение 2 мин. Нижний метиленхлоридный слой объединяют в концентраторе, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Экстракт упаривают досуха на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Затем проводят очистку образца на колонке с флоризилом, как указано в п. 2.5.1.2.

2.5.3. Картофель (клубни)

Навеску 10 г измельченных клубней картофеля помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 30 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя 30 мл и 10 мл ацетонитрила и встряхивая смесь 30 и 5 мин соответственно. Экстракт фильтруют и объединяют в делительную воронку. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила. Экстракты объединяют в делительной воронке. Далее поступают, как описано в п. 2.5.2.2.

2.5.4. Зеленая масса пшеницы

Навеску 10 г измельченной зеленой массы пшеницы помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 100 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила и встряхивая смесь каждый раз по 15 мин. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке.

К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 5 г хлорида натрия, интенсивно встряхивают и оставляют на 10 минут. По истечении этого времени и после разделения слоев в делительной воронке нижний водный слой с остатком нерастворившегося хлорида натрия отбрасывают. К оставшемуся в делительной воронке ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Далее проводят очистку экстракта на колонке, как указано в разделе 2.5.1.2.

2.5.5. Солома пшеницы

Навеску 5 г измельченной соломы помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 100 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила и встряхивая смесь каждый раз по 15 мин. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке.

К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Затем проводят очистку образца на колонке с флоризилом, как указано в п. 2.5.1.2.

2.5.6. Зерно

Навеску 10 г измельченного зерна помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 50 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила и встряхивая смесь каждый раз по 15 мин. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке.

К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Затем проводят очистку образца на колонке с флоризилом, как указано в п. 2.5.1.2.

2.6.1. Условия хроматографирования

Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с измеряемой длиной волны

2.6.2. Обработка результатов анализа

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

Калинин В.А., профессор, к. с-х. н.; Калинина Т.С, к. с-х. н.; Довгилевич Е.В., к. биол. н.; Довгилевич А.В., к. хим. н.; Устименко Н.В., к. биол. н.

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева. 127550, Москва, Тимирязевский пр., 2, кафедра химических средств защиты растений. Телефон: 976-43-26.