"МУК 4.1.1130-02. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Ацетамиприда в воде, почве, огурцах, томатах, клубнях и ботве картофеля, зерне и соломе пшеницы и в кормовом разнотравье методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Минздравом России)

1. Методические указания подготовлены: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. Довгилевич А.В.); Всероссийским НИИ фитопатологии (А.М. Макеев и др.); Всероссийским НИИ защиты растений (В.И. Долженко и др.); Санкт-Петербургским НИИ лесного хозяйства (Маслаков С.Е., Л.В. Григорьева и др.), при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России.

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель препарата - Ниппон Сода (Япония).

Торговое наименование препарата - Моспилан 20% р. п.

Название действующего вещества по номенклатуре ИСО - Ацетамиприд.

Структурная формула (не приводится).

Химически чистый Ацетамиприд представляет собой бесцветный кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 98,9 °C.

Может присутствовать в воздухе рабочей зоны в виде аэрозоля.

Краткая гигиеническая характеристика

В РФ установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,06 мг/кг массы человека;

ОДК в почве - 0,6 мг/кг;

ПДК в воде водоемов - 0,02 мг/куб. дм;

МДУ (мг/кг продукции): картофель и зерно пшеницы - 0,5, огурцы, томаты - 0,3.

Область применения

Ацетамиприд - инсектицид системного, контактного и кишечного действия из группы неоникотиноидов, блокирующий никотинзависимые рецепторы ацетилхолина в нервной системе. Эффективно подавляет развитие вредителей из отрядов равнокрылых (тли, белокрылки), полужесткокрылых (клопы), бахромчатокрылых (трипсы) и жесткокрылых в посевах многих культур, особенно овощных, при нормах расхода 75 - 300 г д.в./га.

2.1.1. Принцип метода

Метод основан на высокоэффективной жидкостной хроматографии Ацетамиприда с детектором по поглощению в ультрафиолетовом свете после экстракции его из исследуемой пробы ацетонитридом и очистки экстракта путем перераспределения в несмешивающихся жидкостях, окисления перманганатом калия и колоночной хроматографии на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне "Диапак Амин".

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

2.1.3. Избирательность метода

Метод селективен. Другие пестициды определению не мешают. Избирательность метода обеспечивается сочетанием способов очистки экстракта и хроматографического определения.

2.2.1. Реактивы и материалы

2.2.2. Приборы и оборудование

Отбор проб должен проводиться в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (21.08.79, N 2058).

Отобранную пробу при невозможности проведения анализа в течение 5 ч с момента отбора следует хранить в замороженном состоянии при температуре не выше -18 °C, при этом анализ следует проводить не позднее чем через 7 суток со дня отбора пробы.

2.4.1. Подготовка растворителей

Все растворители используют свежеперегнанными.

Ацетонитрил, хранившийся более года, перед перегонкой кипятят с пятиокисью фосфора в колбе с обратным холодильником. Перегонку растворителей проводят, строго отбирая фракцию, соответствующую по температуре кипения основному веществу.

2.4.2. Приготовление стандартных растворов Ацетамиприда

Основной раствор Ацетамиприда готовят, количественно перенося 10 мг Ацетамиприда в мерную колбу вместимостью 100 мл. В колбу вносят 20 мл ацетонитрила, содержимое колбы перемешивают до полного растворения кристаллов Ацетамиприда. Объем в колбе доводят до метки ацетонитрилом, после чего содержимое колбы тщательно перемешивают. Получают раствор Ацетамиприда концентрацией 100 мкг/мл.

Рабочие растворы Ацетамиприда готовят, перенося в мерные колбы вместимостью 100 мл 1,00, 0,75, 0,50, 0,25 и 0,10 мл основного раствора. Объемы в колбах доводят до метки смесью гексан-изопропанол-ацетонитрил (70:25:5, по объему), содержимое колб тщательно перемешивают. Получают рабочие растворы концентрациями соответственно 1; 0,75; 0,5; 0,25 и 0,1 мкг/мл.

Стандартные растворы Ацетамиприда хранят в холодильнике. Срок годности стандартных растворов - 3 мес.

2.4.3. Подготовка колонки для очистки экстракта

Колонка для очистки экстракта готовится непосредственно в процессе испытания. На дно колонки помещают ватный тампон, на который насыпают слой серно-кислого натрия толщиной 5 мм и суспензию 2 г силикагеля в 20 мл смеси гексан-хлороформ (1:3). Не позволяя просохнуть верхней кромке слоя силикагеля, на него насыпают слой серно-кислого натрия толщиной 10 мм. В момент достижения растворителем верхней кромки слоя серно-кислого натрия колонка готова к внесению экстракта.

2.4.4. Проверка хроматографического поведения Ацетамиприда на колонке для очистки экстракта

Хроматографическое поведение Ацетамиприда проверяют каждый раз при использовании новой партии силикагеля. Для этого в подготовленную колонку вносят 2 мл раствора Ацетамиприда в смеси гексан-хлороформ (1:3) массовой концентрацией 50 мкг/мл. Раствору дают впитаться в фильтрующий слой, после чего через колонку пропускают 50 мл смеси гексан-хлороформ (1:3) со скоростью не более 5 мл/мин., элюат отбрасывают. Через колонку пропускают 80 мл хлороформа, отбирая фракции элюата объемом по 10 мл. Каждую отобранную фракцию упаривают на ротационном испарителе досуха, остаток в отгонной колбе перерастворяют в 2 мл смеси гексан-изопропанол-ацетонитрил (70:25:5) и исследуют на жидкостном хроматографе по п. 2.5.3. При обнаружении Ацетамиприда в последних двух фракциях элюата в методику очистки экстракта по п. 2.5.2 вносят соответствующие коррективы.

2.4.5. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В цилиндр вместимостью 500 мл вносят 25 мл ацетонитрила и 125 мл изопропанола. Объем в цилиндре доводят до 500 мл гексаном. Содержимое цилиндра переносят в колбу с притертой пробкой и хранят в той же колбе. Срок годности подвижной фазы - 3 дня.

2.4.6. Подготовка хроматографа

На хроматограф устанавливают требуемую колонку и кондиционируют ее подвижной фазой при скорости потока 0,4 мл/мин. в течение 30 мин. На детекторе устанавливают длину волны 246 нм и чувствительность 0,08 ед. оптической плотности на шкалу. Чувствительность регистрирующего устройства устанавливают на уровне 10 мВ, скорость подачи ленты самописца - 4 мм/мин.

2.4.7. Построение градуировочного графика

В инжектор хроматографа вводят по 20 мкл каждого рабочего раствора Ацетамиприда и регистрируют время удерживания и площадь пика Ацетамиприда. Время удерживания Ацетамиприда может находиться в интервале 13,4 - 14,9 мин. в зависимости от точности воспроизведения состава подвижной фазы и температуры воздуха в лабораторном помещении. Градуировочный график строят на миллиметровой бумаге, откладывая по оси абсцисс количество введенного Ацетамиприда в нг (определяется как произведение концентрации рабочего раствора в нг/мкл на объем введенного раствора в мкл) и по оси ординат соответствующую высоту пика Ацетамиприда.

2.5.1. Экстракция

Пробу воды объемом 20 мл переносят в делительную воронку и экстрагируют Ацетамиприд хлороформом двумя порциями по 20 мл при встряхивании в течение 1 мин. Объединенный экстракт обезвоживают в плоскодонной колбе добавлением 10 г безводного сульфата натрия и упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток перерастворяют в 1 мл смеси гексан-изопропанол-ацетонитрил (70:25:5 по объему) и используют для хроматографического анализа.

Пробу почвы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу и заливают 100 мл смеси ацетонитрил-вода (1:1 по объему). Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 20 мин. или выдерживают на ультразвуковой бане в течение 5 мин., после чего фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр под вакуумом. Фильтр с осадком переносят в коническую колбу, куда добавляют 20 мл ацетонитрила. Содержимое колбы интенсивно перемешивают вручную в течение 2 мин., после чего фильтруют аналогичным образом.

Объединенный фильтрат переносят в делительную воронку, куда вносят 100 мл раствора хлорида натрия массовой концентрацией 100 г/л и 100 мл гексана. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. Экстракцию гексаном повторяют, используя свежую порцию объемом 100 мл и отбрасывая верхний гексановый слой. Ацетамиприд экстрагируют из водно-ацетонитрильной фазы хлороформом двумя порциями по 100 мл, каждый раз отбирая нижний хлороформный слой. Объединенный экстракт обезвоживают в плоскодонной колбе добавлением 20 г безводного сульфата натрия и упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в отгонной колбе перерастворяют в 5 мл смеси гексан-хлороформ (1:3).

Навеску гомогенизированной пробы огурцов и томатов массой 20 г помещают в стакан гомогенизатора, куда вносят 100 мл ацетонитрила. Содержимое стакана гомогенизируют в течение 5 мин., после чего фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр под вакуумом. Фильтр с осадком переносят в коническую колбу, куда добавляют 50 мл ацетонитрила.

Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 20 мин. или выдерживают на ультразвуковой бане в течение 5 мин., после чего фильтруют аналогичным образом. Объединенный фильтрат переносят в делительную воронку, куда вносят 250 мл раствора хлорида натрия массовой концентрацией 40 г/л и 100 мл гексана. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. Экстракцию гексаном повторяют, используя свежую порцию объемом 100 мл и отбрасывая верхний гексановый слой.

Ацетамиприд экстрагируют из водно-ацетонитрильной фазы хлороформом двумя порциями по 100 мл, каждый раз отбирая нижний хлороформный слой. Объединенный экстракт обезвоживают в плоскодонной колбе добавлением 20 г безводного сульфата натрия и упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в отгонной колбе перерастворяют в 5 мл смеси гексан-хлороформ (1:3).

Навеску гомогенизированной пробы клубней картофеля массой 20 г и ботвы картофеля массой 10 г помещают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 100 мл ацетонитрила. Содержимое колбы перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин., после чего фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр под вакуумом. Фильтр с осадком переносят в коническую колбу, куда добавляют 50 мл ацетонитрила. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 20 мин. или выдерживают на ультразвуковой бане в течение 5 мин., после чего фильтруют аналогичным образом, фильтраты объединяют.

При исследовании клубней объединенный фильтрат переносят в делительную воронку, куда вносят 250 мл раствора хлорида натрия массовой концентрацией 40 г/л и 100 мл гексана. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. Экстракцию гексаном повторяют, используя свежую порцию объемом 100 мл и отбрасывая верхний гексановый слой.

Ацетамиприд экстрагируют из водно-ацетонитрильной фазы хлороформом двумя порциями по 100 мл, каждый раз отбирая нижний хлороформный слой. Объединенный экстракт обезвоживают в плоскодонной колбе добавлением 20 г безводного сульфата натрия и упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в отгонной колбе перерастворяют в 5 мл смеси гексан-хлороформ (1:3).

При исследовании ботвы объединенный ацетонитрильный экстракт концентрируют на ротационном вакуумном испарителе до объема около 20 мл при температуре не выше 50 °C, остаток переносят в цилиндр вместимостью 50 мл. Отгонную колбу ополаскивают двумя порциями ацетонитрила объемом по 10 мл, смыв переносят в тот же цилиндр.

Содержимое цилиндра доводят до объема 50 мл и переносят в делительную воронку, куда вносят 250 мл раствора хлорида натрия массовой концентрацией 20 г/л и 100 мл гексана. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. Экстракцию гексаном повторяют, используя свежую порцию объемом 100 мл и отбрасывая верхний гексановый слой. В делительную воронку вносят 5 мл серной кислоты (по капле при перемешивании) и 10 мл свежеприготовленного раствора марганцовокислого калия массовой концентрацией 15 г/л. Содержимое воронки перемешивают и выдерживают 5 мин., после чего Ацетамиприд экстрагируют из водно-ацетонитрильной фазы хлороформом двумя порциями по 100 мл, каждый раз отбирая нижний хлороформный слой.

Объединенный экстракт встряхивают в делительной воронке с 10 мл раствора гидроокиси калия концентрацией 0,05 N, после разделения фаз верхний водный слой отбрасывают. Для удаления остатков щелочи хлороформный экстракт встряхивают в делительной воронке с 10 мл воды, после разделения фаз верхний водный слой отбрасывают. Объединенный экстракт обезвоживают в плоскодонной колбе добавлением 20 г безводного сульфата натрия и упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в отгонной колбе перерастворяют в 5 мл смеси гексан-хлороформ (1:3).

Навеску гомогенизированной пробы зерна пшеницы массой 20 г, соломы пшеницы и зеленой массы кормовых трав массой 10 г помещают в плоскодонную колбу. В колбу вносят 100 мл ацетонитрила. Содержимое колбы перемешивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин., после чего фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр под вакуумом. При анализе зерна пшеницы фильтр с осадком переносят в коническую колбу, куда добавляют 50 мл ацетонитрила. Содержимое колбы встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 20 мин. или выдерживают на ультразвуковой бане в течение 5 мин., после чего фильтруют аналогичным образом, фильтраты объединяют.

При анализе соломы пшеницы и зеленой массы кормовых трав от воронки Бюхнера с осадком отсоединяют источник вакуума, после чего к слою осадка приливают 100 мл ацетонитрила, дают растворителю равномерно распределиться по осадку, выдерживают 10 мин., далее фильтруют растворитель под вакуумом, фильтраты объединяют.

Ацетонитрильные экстракты концентрируют на ротационном вакуумном испарителе до объема около 20 мл при температуре не выше 50 °C, остаток переносят в цилиндр вместимостью 50 мл. Отгонную колбу ополаскивают двумя порциями ацетонитрила объемом по 10 мл, смыв переносят в тот же цилиндр. Содержимое цилиндра доводят до объема 50 мл и переносят в делительную воронку, куда вносят 250 мл раствора хлорида натрия массовой концентрацией 20 г/л и 100 мл гексана. Содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после разделения фаз верхний гексановый слой отбрасывают. Экстракцию гексаном повторяют, используя свежую порцию объемом 100 мл и отбрасывая верхний гексановый слой.

В делительную воронку вносят 5 мл серной кислоты (по каплям при перемешивании) и 10 мл свежеприготовленного раствора марганцовокислого калия массовой концентрацией 15 г/л. Содержимое воронки перемешивают и выдерживают 5 мин., после чего Ацетамиприд экстрагируют из водно-ацетонитрильной фазы хлороформом двумя порциями по 100 мл, каждый раз отбирая нижний хлороформный слой. Объединенный экстракт встряхивают в делительной воронке с 10 мл раствора гидроокиси калия концентрацией 0,05 N, после разделения фаз верхний водный слой отбрасывают.

Для удаления остатков щелочи хлороформный экстракт встряхивают в делительной воронке с 10 мл воды, после разделения фаз верхний водный слой отбрасывают. Объединенный экстракт обезвоживают в плоскодонной колбе добавлением 20 г безводного сульфата натрия и упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в отгонной колбе перерастворяют в 5 мл смеси гексан-хлороформ (1:3).

2.5.2. Очистка экстракта

В подготовленную по п. 2.4.3 колонку вносят экстракт. Экстракту дают впитаться в фильтрующий слой, после чего через колонку пропускают 50 мл смеси гексан-хлороформ (1:3) со скоростью не более 5 мл/мин., элюат отбрасывают.

В колонку вносят 60 мл хлороформа. После прекращения выхода элюата из колонки его упаривают на ротационном испарителе в остродонной колбе досуха, остаток в колбе перерастворяют в 2,0 мл смеси гексан-изопропанол-ацетонитрил (70:25:5 по объему).

2.5.3. Хроматографический анализ

Условия хроматографирования.

Колонка длиной 250 мм, внутренним диаметром 3 мм, заполненная сорбентом Нуклеосил CN.

Подвижная фаза - гексан-изопропанол-ацетонитрил (70:25:5 по объему).

Скорость потока - 0,4 мл/мин.

Детектор - спектрофотометрический, длина волны - 246 нм, чувствительность - 0,08 ед. оптической плотности на шкалу.

Чувствительность самописца - 10 мВ.

Скорость протяжки ленты самописца - 4 мм/мин.

Время удерживания Ацетамиприда - 13,4 - 14,9 мин.

Линейный диапазон детектирования Ацетамиприда - 2 - 20 нг.

В инжектор хроматографа вводят 20 мкл очищенного и сконцентрированного экстракта. При обнаружении на хроматограмме пика с временем удерживания, соответствующим времени удерживания пика Ацетамиприда в рабочем растворе, определяют его высоту и по градуировочному графику находят соответствующую ей массу Ацетамиприда.

Если высота пика Ацетамиприда превышает верхнее значение градуировочного графика, экстракт разбавляют той же смесью растворителей, фиксируют новое значение объема экстракта и проводят его повторный хроматографический анализ.

2.5.4. Обработка результатов

При анализе необходимо соблюдать правила безопасности, рекомендуемые для работы с органическими растворителями и соответствующие "Правилам устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лечебных и санитарно-эпидемиологических учреждениях системы" N 2455-81 от 20.10.81.

Цимбалаев С.Р., Есютина Г.С. (Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП), 142700, г. Видное, Московской обл., ул. Школьная, 78).