"МУК 4.1.1448-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств диниконазола в семенах и масле подсолнечника методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 24.06.2003)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина), Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к.х.н. А.В. Довгилевич) при участии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Август.

Торговое наименование: ВИАЛ.

Действующее вещество: диниконазол М (ISO).

Структурная формула: (не приводится).

(Е)-(R)-1-(2,4-дихлорфенил)-4,4-диметил-2-(1Н-1,2,4-триазол-1-ил)пент-1-ен-3-ол(IUPAC).

Мол. масса: 326,2.

Химически чистый препарат - бесцветное кристаллическое вещество.

Температура плавления: 134 - 156 °С.

Давление паров при 20 °С - 2,93, при 25 °С - 4,9 mPa.

Растворимость в воде при 25 °С - 4 мг/л;

в н-гексане - 0,7, ксилоле - 14, метаноле и ацетоне - 95 (в г/кг при 25 °С).

Вещество стабильно на свету при повышенной температуре и влажности.

Класс токсичности по ВОЗ - III, ЕПА - III.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ПДК в воде водоемов (мг/куб. дм) - 0,004,

ПДК в почве (мг/кг) - не нормирован,

МДУ в продукции (мг/кг):

Зерно хлебных злаков - 0,05.

Область применения: фунгицид для борьбы с мучнистой росой, паршой, ржавчиной и др. заболеваниями виноградной лозы, зерновых, сахарной свеклы, плодовых, овощных и масличных культур. Используется как протравитель семян на зерновых.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на извлечении диниконазола М из семян и масла подсолнечника водно-ацетоновым раствором или ацетонитрилом с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкостями и на колонке с флорисилом. Количественное определение проводят методом газожидкостной хроматографии с использованием электронозахватного детектора.

2.1.2. Избирательность метода

Избирательность метода обеспечивается очисткой экстрактов анализируемых проб и сочетанием условий хроматографирования. Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Аналитический стандарт диниконазола 99,8%.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Азот газообразный в баллонах с редуктором, ТУ-6-16-40-14-88.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Стекловата.

Флорисил 150 - 250 мю m (Merck, Германия), содержание воды <= 2,5%.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Хлороформ, ч.д.а., ТУ-2631-020-11291058-96.

Насадка для колонки: хроматон N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5% SE-30 (Чехия).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Элюент для колоночной хроматографии N 1: гексан-этилацетат (50:50, по объему).

Элюент для колоночной хроматографии N 2: гексан-этилацетат (20:80, по объему).

Газовый хроматограф Цвет-550 М или аналогичный с ДЭЗ (ДПР) и стеклянной насадочной колонкой длиной 1 м; внутренним диаметром 3 мм.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Весы технические ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-80.

Мельница лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Микрошприц МШ-10, МШ-10М, ТУ 2-833-106.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Стаканы химические, ГОСТ 25336-82Е.

Колонка стеклянная хроматографическая длиной 25 см, диаметром 10 мм.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Для длительного хранения пробы семян подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы семян подсолнечника измельчают на лабораторной мельнице.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку, заполненную хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5% SE-30, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °С в течение 8 - 10 часов.

2.5.3. Приготовление стандартного и градуировочных растворов.

Берут точную навеску диниконазола (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетоне и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя для разбавления гексан. Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 6 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют градуировочные растворы.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация диниконазола в растворе) в хроматограф вводят по 1 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты или площади пиков и строят график зависимости среднего значения высоты (площади) пика от концентрации диниконазола в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.5. Подготовка колонки с флорисилом для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты и вносят суспензию 4 г флорисила в 20 мл смеси гексан:этилацетат (1:1, по объему), дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку промывают 20 мл этой же смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения диниконазола на колонке с флорисилом

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,5 мл стандартного раствора диниконазола с концентрацией 1 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 мл элюента N 1 и вносят в колонку. Колбу обмывают еще 2 мл элюента N 1 и также вносят в колонку. Затем промывают колонку 20 мл гексана и элюируют диниконазол 50 мл элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл гексана и анализируют на содержание диниконазола по п. 2.6.4. Фракции, содержащие диниконазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл гексана и анализируют по п. 2.6.4. Рассчитывают содержание диниконазола в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: профиль вымывания диниконазола может меняться при использовании новой партии сорбента.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6.1. Экстракция диниконазола из семян подсолнечника

Навеску измельченных на лабораторной мельнице семян подсолнечника массой 10 г помещают в коническую колбу на 250 мл, заливают 50 - 100 мл смеси растворителей ацетон - вода (в соотношении 1:1) и экстрагируют диниконазол в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр ("красная лента"). Экстракцию повторяют дважды 30 мл той же смеси. Объединенный фильтрат помещают в делительную воронку и переэкстрагируют диниконазол хлороформом трижды порциями по 30 мл. Объединенные хлороформные экстракты фильтруют через слой безводного сернокислого натрия. Полученный раствор упаривают на ротационном испарителе при температуре бани 50 °С до полного удаления хлороформа. Далее проводят очистку экстрактов по п. 2.6.3.

2.6.2. Экстракция диниконазола из масла подсолнечника

Навеску масла 10 г растворяют в 50 мл гексана и экстрагируют диниконазол 50 мл ацетонитрила в УЗ-ванне в течение 15 мин. Полученную смесь помещают в делительную воронку объемом 250 мл. После расслоения <*> нижний ацетонитрильный слой сливают, из верхнего гексанового слоя экстрагируют диниконазол ацетонитрилом еще дважды порциями по 25 мл. К объединенному ацетонитрильному экстракту добавляют воду в соотношении ацетонитрила:вода = 1:4 и переэкстрагируют диниконазол хлороформом трижды порциями по 30 мл. Объединенные хлороформные экстракты сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре 50 °С. Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетона и помещают в морозильную камеру с температурой -18 °С на 2 часа. Охлажденный ацетоновый раствор декантируют в круглодонную колбу на 10 мл через фильтр "красная лента", после чего фильтр промывают 2 мл ацетона. Полученный раствор упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Далее очистку проводят по п. 2.6.3.

--------------------------------

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий можно добавить несколько мл насыщенного раствора хлористого натрия.

2.6.3. Очистка экстрактов на колонке с флорисилом

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. п. 2.6.1 и 2.6.2 экстрактов семян или масла, количественно переносят двумя порциями по 2 мл смеси гексан - этилацетат (1:1, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 20 мл гексана, которые отбрасывают. Диниконазол элюируют 50 мл элюента N 2 (гексан - этилацетат = 2:8). Весь элюат собирают в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 50 °С. Сухой остаток растворяют в 1 - 2 мл гексана и 1 мкл раствора вводят в хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования

Газовый хроматограф "Цвет-550 М" с ДПР (ДЭЗ) или аналогичный.

1. Колонка стеклянная 1 м х 3 мм, заполненная хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5% SE-30.

Температура колонки 230 °С, испарителя - 240 °С, детектора - 320 °С.

Скорость газа-носителя (азот) через колонку 45 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы 1 мкл.

Время удерживания диниконазола 1 мин. 55 сек.

2. Колонка стеклянная 1 м х 3 мм, заполненная хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5% ХЕ-60.

Температура колонки 220 °С, испарителя 240 °С, детектора 320 °С.

Скорость газа-носителя (азот) через колонку 45 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы 1 мкл.

Время удерживания диниконазола 2 мин. 25 сек.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2 нг.

2.6.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание диниконазола в образце семян или масла (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств диниконазола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие чем стандартный раствор диниконазола 2 мкг/мл, разбавляют.

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации газового хроматографа и электрооборудования до 400 В.

Долженко В.И., Цибульская И.А., Блинова Т.Ф.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (ВИЗР).

196608, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3. Телефон 470-41-98.