"МУК 4.1.1132-02. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств 2,4-Д в воде, зерне, соломе зерновых культур и зерне кукурузы методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Минздравом России)

1. Методические указания подготовлены: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. Довгилевич А.В.); Всероссийским НИИ фитопатологии (А.М. Макеев и др.); Всероссийским НИИ защиты растений (В.И. Долженко и др.); Санкт-Петербургским НИИ лесного хозяйства (Маслаков С.Е., Л.В. Григорьева и др.), при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России.

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Дау АгроСайенсес, Нуфарм ГмбХ и Ко КГ.

Торговое название препарата: 2,4-Д, ВР; Дезормон ВР, Дикопур Ф.

Название действующего вещества по ИСО: 2,4-Д.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.

Структурная формула (не приводится).

Белое кристаллическое вещество.

Давление паров: 0,011 mPa (20 °C).

Температура плавления: 141 °C.

Растворимость в воде 311 мг/л (pH 1, 25 °C), 0,6 г/л (20 °C). В этаноле - 1250, диэтиловом эфире - 243, гептане - 1,1 (все в г/кг, 20 °C).

2,4-Д стабильна в растворах сильных кислот и образует водорастворимые соли со щелочными металлами и аминами; рКа = 2,73.

Краткая токсикологическая характеристика

В России установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,0001 мг/кг/сутки; ПДК в почве - 0,1 мг/кг (транслокационный лимитирующий показатель); ПДК в воде водоемов - 0,0002 мг/куб. дм (санитарно-токсикологический показатель); МДУ в сельскохозяйственной продукции (мг/кг): все пищевые продукты - не допускается (предел обнаружения 0,005 мг/кг).

Область применения препарата

2,4-Д - селективный, системный гербицид, эффективно подавляющий рост и развитие большинства двудольных широколистных сорных растений. У чувствительных к препарату растений происходит угнетение процессов фотосинтеза, стимуляция или угнетение дыхания, нарушение метаболизма азотсодержащих соединений, разобщение процессов окисления и фосфорилирования, снижение синтеза макроэргических фосфорных соединений и другие нарушения. Устойчивые растения обладают большей способностью к детоксикации гербицида и регуляторными системами, обеспечивающими стабильность обменных реакций.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении 2,4-Д в виде бутилового эфира с помощью газожидкостной хроматографии с электронозахватным детектором после экстракции ее водно-спиртовым раствором щелочи, процесса высаливания в водной фазе, перераспределения в органический растворитель и очистке на концентрирующем патроне Диапак Амин. Идентификация проводится по времени удерживания. Количественное определение - методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 и 2.

2.1.3. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания сельскохозяйственных культур (хлор- и фосфорорганические пестициды, симм-триазины, амиды, синтетические пиретроиды, фенилмочевины, тио- и дитиокарбаматы).

2.2.1. Реактивы, растворы и материалы

2.2.2. Приборы и оборудование

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы зерна и соломы зерновых культур доводятся до стандартной влажности и хранятся в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, не доступном для грызунов. Зерно размалывают на лабораторной мельнице. Солому нарезают ножницами и также измельчают в мельнице.

2.4.1. Приготовление стандартных растворов

Взвешивают 50 мг 2,4-Д кислоты в мерной колбе на 50 мл, растворяют навеску в этаноле и доводят объем до метки этанолом (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/мл). Стандартный раствор N 1 можно хранить в холодильнике в течение 1 месяца. Методом последовательного разбавления готовят стандартный раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/мл. Стандартный раствор N 2 используют для проверки хроматографического поведения 2,4-Д на патроне Диапак Амин (п. 2.4.2.1).

Для построения калибровочного графика при определении остаточных количеств 2,4-Д в зерне и соломе зерновых культур отбирают 1 мл стандартного раствора N 2 в виал, удаляют растворитель током теплого воздуха и проводят бутилирование как указано в разделе 2.4.5. Получают стандартный раствор N 3 бутилового эфира 2,4-Д с концентрацией 0,1 мкг/мл. Из него последовательным разбавлением готовят растворы с концентрациями: 0,05; 0,025; 0,01 мкг/мл. Вводят в хроматограф по 1 мкл каждого из полученных четырех растворов и после интегрирования хроматограммы строят график зависимости отклика детектора (площади пика) от концентрации 2,4-Д (мкг/мл).

2.4.2. Подготовка концентрирующих патронов Диапак Амин для очистки экстракта

Все процедуры проводят с использованием вакуума.

При работе с концентрирующими патронами Диапак используется вода бидистиллят.

2.4.2.1. Кондиционирование патрона. Патрон Диапак Амин устанавливают на алонж с отводом для вакуума, вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 мл (используют как емкость для элюентов).

Пропускают через патрон Диапак Амин 20 мл ацетона со скоростью не более 2 мл/мин. и высушивают 5 минут. Элюат отбрасывают.

2.4.2.2. Проверка хроматографического поведения 2,4-Д на патроне Диапак Амин. Упаривают 1 мл аналитического стандарта N 2 2,4-Д в концентраторе на ротационном вакуумном испарителе. Сухой остаток разводят в 1 мл ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют 1 мл воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор наносят на подготовленный патрон Диапак Амин (п. 2.4.2.1). Патрон промывают 5 мл ацетона со скоростью не более 2 мл/мин., элюат отбрасывают. Затем с патрона последовательно собирают в отдельные концентраторы две фракции по 5 мл 0,2 М соляной кислоты и упаривают их досуха при температуре бани не выше 35 °C. Сухой остаток каждой фракции переносят тремя порциями по 2 мл диэтилового эфира в виал и высушивают током теплого воздуха. Проводят бутилирование как указано в п. 2.4.5.

Газохроматографическим методом определяют содержание 2,4-Д в каждой фракции элюата. Фракции, содержащие 2,4-Д, объединяют, упаривают досуха, вновь растворяют в 5 мл гексана и вводят в хроматограф 1 мкл пробы.

Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смыва 2,4-Д с патрона Диапак Амин и необходимый объем элюирующей смеси.

Примечание: хроматографическое поведение 2,4-Д на патроне обязательно проверяют при отработке методики и при использовании новой партии патронов.

2.4.3. Приготовление водноспиртового раствора щелочи для гидролиза

В мерную колбу объемом 100 мл наливают 50 мл 20%-ного водного раствора едкого натра и доводят объем до метки этиловым спиртом. Раствор тщательно перемешивают и хранят при комнатной температуре в течение одного месяца.

2.4.4. Приготовление раствора для бутилирования

Раствор для бутилирования готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности.

В мерную колбу объемом 100 мл осторожно приливают 2 мл концентрированной серной кислоты к н-бутанолу. Перемешивают раствор и доводят объем до метки бутанолом. Бутилирующую смесь хранят под тягой в течение одного месяца.

2.4.5. Бутилирование

К сухому остатку в виал добавляют 1 мл 2%-ного раствора концентрированной серной кислоты в бутаноле. Плотно закрывают виал крышкой и помещают в блок для виал, нагретый до 100 °C. Бутилирование проводят в течение 60 мин. Далее виал охлаждают до комнатной температуры, добавляют 5 мл (для соломы 10 мл) гексана, 20 - 25 мл дистиллированной воды. Смесь интенсивно встряхивают и после разделения фаз из верхнего гексанового слоя аликвоту 1 мкл вводят в хроматограф.

Примечание: При отсутствии виал и нагревательного блока можно использовать концентраторы с притертыми пробками и водяные или песчаные бани. При этом следует внимательно следить за герметичностью сосудов.

2.4.6. Подготовка и кондиционирование колонки

Капиллярную кварцевую колонку НР-5 длиной 30 м или другую аналогичную по характеристикам одним концом подсоединяют к инжектору. Проверяют утечку газа, устанавливают необходимую скорость потока газа (18 - 20 см/с). Кондиционируют колонку при температуре термостата 270 °C в течение 6 - 8 ч. Далее колонку подсоединяют к детектору и выставляют рабочие режимы.

2.5.1. Определение остаточных количеств 2,4-Д в зерне и соломе зерновых культур, зерне кукурузы

2.5.1.1. Экстракция и предварительная очистка. Из измельченного на лабораторной мельнице среднего образца зерна (соломы) взвешивают аналитическую пробу 10 г (5 г) в центрифужные полипропиленовые банки. Добавляют 50 мл (для соломы 100 мл) водноспиртового раствора щелочи и встряхивают пробу на встряхивателе в течение 1 ч, оставляют на ночь. После выстаивания пробу встряхивают 15 мин., и экстракт фильтруют методом декантации через фильтр "красная лента" в концентратор.

Экстракт упаривают досуха. Остаток в концентраторе растворяют в 100 мл воды, добавляют 10 г хлористого натра, перемешивают содержимое и фильтруют в делительную воронку. Водную фазу подкисляют 4Н серной кислотой до pH = 1, добавляют 30 мл диэтилового эфира. Делительную воронку встряхивают в течение двух минут (Осторожно, необходимо дегазировать смесь!) и после полного разделения слоев нижний водный слой собирают в плоскодонную колбу, а верхний эфирный слой собирают в концентратор, пропуская через безводный сульфат натрия. Водную фазу возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию два раза с тем же количеством эфира. Объединенный эфирный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C.

2.5.1.2. Очистка экстракта на патроне Диапак Амин. Сухой остаток в концентраторе разводят в 1 мл ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют 1 мл воды, смесь тщательно перемешивают, и полученный раствор наносят на подготовленный патрон Диапак Амин (п. 2.4.2.1). Патрон промывают 5 мл ацетона, элюат отбрасывают. Далее с патрона в концентратор элюируют 2,4-Д 10 мл 0,2 М соляной кислоты. Упаривают элюат досуха при температуре бани не выше 35 °C. Сухой остаток переносят тремя порциями по 2 мл диэтилового эфира в виал и высушивают током теплого воздуха. Проводят бутилирование, как указано в пункте 2.4.5.

2.6.1. Условия хроматографирования

2.6.1.1. Капиллярная хроматография. Хроматограф газовый "Кристалл 2000М" с электронозахватным детектором (ЭЗД). Капиллярная кварцевая колонка НР-5 (Crosslinked 5% PH ME Siloxane), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - 320 °C, испарителя - 230 °C.

Программированный нагрев колонки - с 120 до 200 °C по 4 град./мин., с 200 до 240 °C по 6 град./мин.

Газ 1: тип регулятора расхода газа РРГ 11, давление 84 кПа.

Газ 2 (гелий) - расход 0,5 мл/мин., сброс 1:80.

Режим Splitless, начало сброса 15 с, длительность сброса 5 мин., минимальный расход 20 мл/мин.

Газ 3 (азот, поддув детектора) - 60 мл/мин.

Продувка детектора и испарителя по 60 мл/мин. в течение 2 мин. при температуре колонки 240 °C.

Абсолютное время удерживания бутилового эфира 2,4-Д - 20 мин. 18 с, окно 1%.

Объем пробы, вводимый в испаритель, - 1 мкл.

Образцы, дающие площадь пика больше, чем стандартный раствор с концентрацией 0,01 мкг/мл, разбавляют.

Неподвижная фаза OV-17,5% на Хроматоне-N-супер (0,12 - 0,16 мм).

Колонка стеклянная спиральная, длина 2 м, внутренний диаметр 3 мм.

Температура: термостата колонки - 240 °C;

термостата испарителя - 280 °C;

термостата детектора - 340 °C.

Скорость газа-носителя - азота - 30 мл/мин.

Объем пробы, вводимой в испаритель, - 3 мкл.

Линейность детектирования - 0,03 - 0,6 нг.

Время удерживания - 1 мин. 55 с.

2.6.2. Обработка результатов анализов

Для обработки результатов анализов используется "Программа сбора и обработки хроматографической информации Хроматек Аналитик", версия 1.20.

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

Калинин В.А., профессор, к. с-х. н., Калинина Т.С., к. с-х. н., Рыбакова О.И.

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева. 127550, Москва, Тимирязевский пр., 2, кафедра химических средств защиты растений. Телефон: 976-02-20, факс: 976-43-26. E-mail: tlmaa@online.ru.