"МУК 4.1.1455-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств клефоксидима в воде, почве, зерне и соломе риса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 24.06.2003)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина), Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к.х.н. А.В. Довгилевич) при участии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: БАСФ АГ, Германия.

Торговое название: АУРА.

Действующее вещество: клефоксидим (BAS 625 Н).

2-[1-(2-(4-хлорфенокси)пропоксиимино)-бутил]-3-оксо-5-тиан-3-илциклогекс-1-енол (ИЮПАК).

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 466,04.

Бесцветная вязкая жидкость.

Температура плавления: 185 °С (с разложением).

Давление паров при 25 °С: <...>

Коэффициент распределения н-октанол/вода: log P = <...>

Растворимость (г/л) при 20 град. С: ацетон и этилацетат - более 700, 2-пропанол - 330, этанол - 67, вода - 5,3 мг/л.

Стабильность к гидролизу при 25 град. С (в темноте): DT = менее 1 часа (рН 5), 140 дней (рН 7) и более 300 дней (рН 9).

Вещество стабильно при нормальных условиях хранения.

Краткая токсикологическая характеристика:

Клефоксидим не токсичен для пчел, птиц и диких животных. Гигиенические регламенты применения вещества в России не установлены.

Область применения препарата:

Клефоксидим - гербицид системного действия из группы ингибиторов биосинтеза жирных кислот. Он быстро проникает в листья и корни вегетирующих растений и передвигается в точки роста. Предназначен для уничтожения однолетних и многолетних злаковых сорных растений в посевах риса, независимо от способа его выращивания. Применяется для обработки в период от фазы 2 - 3 листьев до конца кущения у злаковых сорняков (рис при этом должен иметь не менее 3 листьев).

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Аура (BAS 525 Н) (концентрат эмульсии, содержащий 75 г клефоксидима в 1 л препарата) на рисе в качестве избирательного гербицида при норме расхода препарата до 2,7 л/га.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении клефоксидима методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после извлечения вещества из воды хлористым метиленом, из почвы и растительного материала - ацетоном, очистки экстрактов перерастворением в хлористом метилене и на концентрирующих патронах-колонках Диапак-диол и Диадак-амин.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания риса.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Клефоксидим с содержанием д.в. 98,8% (БАСФ, Германия).

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил, ч., ТУ 6-09-3534-82.

Вода дистиллированная или деионизованная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Концентрирующие патроны Диапак-диол, АО БиоХимМак (117899, Москва, Воробьевы горы, МГУ), ТУ 4215-002-05451931-94.

Концентрирующие патроны Диапак-амин, АО БиоХимМак (117899, Москва, Воробьевы горы, МГУ), ТУ 4215-002-05451931-94.

Метилен хлористый, ГОСТ 12794-80.

Натрия сульфат безводный, х.ч., ГОСТ 4156-76.

Спирт метиловый, х.ч., ГОСТ 6995-77.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (85:15, по объему).

Элюент для Диапак-диола: смесь гексан:хлористый метилен (1:1, по объему).

Фильтры бумажные синяя лента, ТУ 6-09-1678.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Altex (США) или аналогичный.

Самописец регистрирующий фирмы Kipp. a. Zonen BD 41 или аналогичный.

Колонка хроматографическая длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Диасорбом 130-С15 Т или Диасорбом 130-С8 Т зернением 7 мкм (АО БиоХимМак; Москва, Воробьевы горы, МГУ).

Шприц для ввода образцов в жидкостной хроматограф емкостью 100 мкл.

Медицинский шприц с разъемом типа Люер для ввода образцов в концентрирующий патрон Диапак.

Аппарат для встряхивания АВУ, ТУ 64-1-1081-83.

Весы аналитические типа ВЛР-200, ГОСТ 19401-74.

Водоструйный насос, ГОСТ 10695-75.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 45-22-236-79, или аналогичная.

Прибор для перегонки при атмосферном давлении.

Ротационный испаритель, тип ИР-1М, ТУ 25-11-917-76.

Воронка Бунзена, ГОСТ 0147-73.

Воронки для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Колба Бунзена, ГОСТ 5614-75.

Колбы конические с притертыми пробками вместимостью 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные вместимостью 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Колбы грушевидные вместимостью 50, 100, 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2 и 5 мл, ГОСТ 20292-74Е.

Пробирки градуированные с притертыми пробками вместимостью 5 и 10 мл, ГОСТ 10515-75.

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100 и 250 мл, ГОСТ 1770-74.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 град. С не более 3 месяцев. Пробы почвы высушивают при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния и хранят в стеклянной емкости в холодильнике не более 3 месяцев. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 град. С в течение 2 дней, при температуре -18 град. С в течение месяца.

Перед анализом зерно и солому размалывают на мельнице, сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетонитрил сушат над пентаксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2. Подготовка подвижной фазы ВЭЖХ

Отмеряют 850 мл ацетонитрила, переносят в мерную колбу на 1000 мл, добавляют 150 мл бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

2.5.3. Кондиционирование колонки и концентрирующих патронов

Промыть колонку для ВЭЖХ смесью ацетонитрил - вода (85:15, по объему) в течение 30 минут при скорости подачи растворителя 1 мл/мин. Включить детектор и подождать стабилизации базовой линии (5 - 15 минут).

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают последовательно с помощью медицинского шприца 10 мл хлористого метилена и 6 мл смеси гексан - хлористый метилен (1:1, по объему), а патрон Диапак-амин - 10 мл ацетона и 6 мл смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) со скоростью 5 мл/мин.

2.5.4. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор клефоксидима с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 98,8% д.в., в метаноле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные раствора с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора клефоксидима соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Рабочие растворы готовятся и используются в день анализа.

2.5.5. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 50 мкл рабочего стандартного раствора клефоксидима с концентрацией 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации клефоксидима в растворе в мкг/мл.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения клефоксидима на концентрирующих патронах-колонках Диапак

2.5.6.1. Диапак-диол

В грушевидную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора клефоксидима с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 мл смеси гексан - хлористый метилен (1:1, по объему) и наносят на кондиционированный патрон. Промывают патрон 5 мл этой же смеси со скоростью 1 мл/мин. Отбирают фракции по 1 мл каждая, упаривают растворитель, остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание клефоксидима по п. 2.7.

Фракции, содержащие клефоксидим, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание клефоксидима в элюате, определяют полноту вымывания вещества из патрона.

2.5.6.2. Диапак-амин

В грушевидную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора клефоксидима с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 2 мл смеси гексан - ацетон (8:2, по объему) и наносят на кондиционированный патрон. Промывают патрон 4 мл смеси гексан - ацетон (8:2) и затем 12 мл ацетона со скоростью 1 мл/мин. Отбирают фракции по 1 мл каждая, упаривают растворитель, остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание клефоксидима по п. 2.7.

Фракции, содержащие клефоксидим, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание клефоксидима в элюате, определяют полноту вымывания вещества из патрона.

Примечание: Профиль вымывания клефоксидима может меняться при использовании новой партии патронов-колонок Диапак и растворителей.

2.6.1. Экстракция клефоксидима

2.6.1.1. Вода. 100 мл предварительно отфильтрованной воды помещают в делительную воронку емкостью 250 мл и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 30 мл при энергичном встряхивании в течение 1 минуты. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 град. С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и анализируют на содержание клефоксидима по п. 2.7.

2.6.1.2. Почва. Навеску (20 г) воздушно-сухой почвы помещают н коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл ацетона и суспензию перемешивают в течение 40 минут на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Почву повторно экстрагируют 50 мл ацетона при встряхивании в течение 20 минут и суспензию фильтруют. Из объединенного фильтрата отбирают четвертую часть объема (около 35 мл) раствора, эквивалентную 5 г почвы, и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 град. С. Дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.2.

2.6.1.3. Зерно, солома. Навеску размолотого зерна (10 г) или соломы (5 г) помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 50 мл ацетона и суспензию перемешивают в течение 30 минут на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок переносят в колбу, приливают 50 мл ацетона и повторно перемешивают 30 минут на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр и из объединенного фильтрата отбирают пятую часть объема (около 20 мл) раствора, эквивалентную соответственно 2 г зерна и 1 г соломы. Растворы упаривают досуха на роторном испарителе при 30 град. С и остатки очищают по п. 2.6.2.

2.6.2. Очистка на патронах Диапак

Сухой остаток в колбе, полученный по п. 2.6.1.2 или 2.6.1.3, растворяют двумя 10 мл порциями хлористого метилена и раствор переносят в грушевидную колбу емкостью 50 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 град. С. Сухой остаток растворяют в 2 мл смеси гексан - хлористый метилен (1:1, по объему) и раствор наносят на кондиционированный патрон Диапак-диол (п. 2.5.3), который затем промывают 5 мл этой же смеси со скоростью 1 мл/мин. Элюат собирают в грушевидную колбу емкостью 25 мл и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 град. С. Остаток переносят двумя 1-мл порциями смеси гексан-ацетон (8:2, по объему) в подготовленный патрон Диапак-амин (п. 2.5.3) и промывают 4 мл этой же смеси, которые отбрасывают. Клефоксидим элюируют из патрона 12 мл ацетона со скоростью 1 мл/мин. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 град. С. Сухой остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание клефоксидима по п. 2.7.

Примечание: При использовании новой партии патронов Диапак или растворителей проводится проверка хроматографического поведения клефоксидима на патронах Диапак-диол и Диапак-амин.

Жидкостной хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Aitex (США) или аналогичный.

Самописец регистрирующий фирмы Kipp. a. Zonen BD 41 или аналогичный.

Хроматографическая колонка длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Диасорб 130-С16 Т6 зернением 7 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза ацетонитрил - вода (85:15, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 мл/мин.

Рабочая длина волны: 280 нм.

Чувствительность детектора: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 50 мкл.

Скорость протяжки ленты самописца: 10 см/час.

Время выхода клефоксидима: около 6 мин.

Линейный диапазон детектирования: 5 - 50 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 1 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С8 Т.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (85:15, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 мл/мин.

Время выхода клефоксидима: 4,8 мин.

Содержание клефоксидима рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

Дубовая Л. В., научный сотр.; Макеев А.М., зав. лабораторией, канд. биол. наук.

ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-86.