"МУК 4.1.1234-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фенамидона и его метаболитов (RPA 405862 и RPA 408056) в воде, почве, картофеле, томатах, луке и огурцах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Минздравом России 16.03.2003)

1. Сборник подготовлен: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. А.В. Довгилевич); при участии Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов). Разработчики методик указаны в конце каждой из них.

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Байер КропСайенс (Германия).

Торговое название: Сектин (Секур).

Действующее вещество: фенамидон (RPA 407213).

(S)-5-метил-2-метилтио-5-фенил-3-фениламино-3,5-дигидроимидазол-4-он (ИЮПАК).

Структурная формула (не приводится).

Препарат малотоксичен для пчел, птиц, зеленых водорослей, дафний, дождевых червей и почвенных микроорганизмов.

Гигиенические нормативы:

ПДК (с учетом метаболита) в воде водоемов - 0,003 мг/куб. дм;

ОДК (с учетом метаболита) в почве - 0,09 мг/кг;

МДУ (с учетом метаболита) в томатах - 0,5 мг/кг; картофеле -0,03 мг/кг.

Основной метаболит фенамидона в воде и растениях: RPA 405862.

5-метил-5-фенил-3-фениламиноимидазолидин-2,4-дион (ИЮПАК).

Структурная формула (не приводится).

Белый порошок без запаха.

Другие физико-химические и токсикологические характеристики метаболита RPA 405862 отсутствуют.

Основной метаболит фенамидона в почве: RPA 408056.

5-метил-2-метилтио-5-фенил-3,5-дигидроимидазол-4-он (ИЮПАК).

Структурная формула (не приводится).

Белый порошок без запаха.

Другие физико-химические и токсикологические характеристики метаболита RPA 408056 отсутствуют.

Область применения препарата. Фенамидон - специфический системный фунгицид широкого спектра действия, обладает защитными и искореняющими свойствами. Высокоэффективен против возбудителей фитофтороза картофеля и томатов, ложной мучнистой росы подсолнечника, огурцов и лука, мильдью винограда. Обычно применяется в смеси с препаратами контактного действия. В настоящее время в России и странах СНГ проходит регистрационные испытания смесевой препарат Сектин, ВДГ (100 г фенамидона + 500 г манкоцеба в 1 кг препарата) при норме расхода фунгицида 1,25 кг/га и 4-кратной обработке за сезон. Механизм действия фенамидона связан с подавлением транспорта электронов и образования АТФ в митохондриях патогенов.

Фенамидон весьма лабильное соединение и достаточно быстро метаболизируется в растениях и объектах окружающей среды. В воде и растениях фенамидон разрушается с образованием 5-метил-5-фенил-3-фениламиноимидазолидин-2,4-диона (RPA 405862), а в почве он метаболизируется до 5-метил-2-метилтио-5-фенил-3,5-дигидроимидазол-4-она (RPA 408056).

Методика основана на определении фенамидона и его метаболитов (RPA 405862 и RPA 408056) с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после извлечения фунгицида и RPA 405862 из воды соответственно гексаном и хлористым метиленом, фенамидона и метаболитов из почвы и растительного материала водным ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с оксидом алюминия и концентрирующем патроне Диапак-диол.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в интенсивной технологии выращивания картофеля, томатов, огурцов и лука.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы почвы, клубней картофеля, плодов томата и огурца и лука хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более суток. Для длительного хранения пробы почвы доводят до воздушно-сухого состояния и хранят в холодильнике при температуре не выше 4 °С в течение 3 месяцев; растительные образцы хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 °С в течение 2 дней, при температуре -18 °С - в течение месяца.

Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, а растительный материал измельчают.

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем растворители последовательно промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

Оксид алюминия V степени активности по Брокману получают добавлением 12% воды к навеске оксида алюминия II степени активности.

При подготовке подвижной фазы N 1 для анализа фенамидона отмеряют 630 мл ацетонитрила, переносят в мерную колбу емкостью 1000 мл, добавляют 370 мл бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

При подготовке подвижной фазы N 2 для анализа метаболита RPA 405862 отмеряют 550 мл ацетонитрила, переносят в мерную колбу емкостью 1000 мл, добавляют 450 мл бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

При подготовке подвижной фазы N 3 для анализа метаболита RPA 408056 отмеряют 300 мл ацетонитрила, переносят в мерную колбу емкостью 1000 мл, добавляют 700 мл бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

Промыть колонку для ВЭЖХ смесью ацетонитрил-вода (63:37, по объему для фенамидона; 55:45, по объему для RPA 405862; 30:70, по объему для RPA 408056) в течение 30 мин. при скорости подачи растворителя 1 мл/мин. Включить детектор и подождать стабилизации базовой линии (5 - 15 мин.).

Основной стандартный раствор фенамидона с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г вещества, содержащего 99,5% д. в., в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,04; 0,08; 0,2 и 0,4 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора фенамидона соответствующим последовательным разведением подвижной фазой N 1 для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Рабочие растворы хранят в холодильнике при температуре не выше 4 °С не более 7 дней.

Основной стандартный раствор метаболита RPA 405862 с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г вещества, содержащего 99,3% д. в., в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,04; 0,08; 0,2 и 0,4 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора метаболита RPA 405862 соответствующим последовательным разведением подвижной фазой N 2 для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Рабочие растворы хранят в холодильнике при температуре не выше 4 °С не более 7 дней.

Основной стандартный раствор метаболита RPA 408056 с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г вещества, содержащего 99,6% д. в., в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,04; 0,08; 0,2 и 0,4 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора метаболита RPA 408056 соответствующим последовательным разведением подвижной фазой N 3 для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Рабочие растворы хранят в холодильнике при температуре не выше 4 °С не более 7 дней.

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 50 мкл рабочего стандартного раствора фенамидона или метаболитов с концентрациями 0,04; 0,08; 0,2 и 0,4 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации вещества в растворе в мкг/мл.

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и приливают около 10 мл гексана. Затем в колонку вносят суспензию 10 г оксида алюминия V степени активности по Брокману в 20 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 мл гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак-диол промывают сначала с помощью медицинского шприца 10 мл хлористого метилена, а затем 5 мл смеси гексан-хлористый метилен (9:1) при анализе фенамидона или 5 мл смеси гексан-хлористый метилен (6:4) при анализе RPA 405862 со скоростью 5 мл/мин.

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора фенамидона с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл гексана и раствор наносят на хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 50 мл гексана и затем 60 мл смеси гексан-хлористый метилен (9:1, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы N 1 для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание фенамидона по п. 2.7.1.

Фракции, содержащие фенамидон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2,5 мл подвижной фазы N 1 для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.7.1. Рассчитывают содержание фенамидона в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Аналогичным образом проводится проверка хроматографического поведения метаболитов RPA 405862 и RPA 408056 на колонке с оксидом алюминия.

Примечание. Профиль вымывания фенамидона и метаболитов может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6.1.1. Вода. 200 мл предварительно отфильтрованной воды помещают в делительную воронку емкостью 500 мл и трижды экстрагируют гексаном порциями по 30 мл при энергичном встряхивании в течение 1 мин. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 мл подвижной фазы N 1 для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание фенамидона по п. 2.7.1.

Водную фазу, оставшуюся после экстракции гексаном, трижды экстрагируют хлористым метиленом (30 + 20 + 20 мл) при встряхивании. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 мл подвижной фазы N 2 для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание метаболита RPA 405862 по п. 2.7.2.

2.6.1.2. Почва. Навеску (50 г) воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу на 500 мл, приливают 40 мл бидистиллированной воды и спустя 20 мин. 160 мл ацетона и суспензию перемешивают в течение 30 мин. на аппарате для встряхивания. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Почву повторно экстрагируют 200 мл 80%-ного водного ацетона в течение 30 мин. и суспензию фильтруют. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 35 мл), эквивалентную 5 г почвы. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.2.

2.6.1.3. Клубни картофеля, плоды томата и огурца, лук. К навеске (25 г) измельченного растительного материала приливают 100 мл смеси ацетон-вода (80:20, по объему) и гомогенизируют 5 мин. при 10000 об./мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу на 250 мл. Остаток на фильтре промывают 50 мл смеси ацетон-вода (80:20, по объему). Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 30 мл), эквивалентную соответственно 5 г ткани. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.2.

Аликвоту почвенного (из п. 2.6.1.2) или растительного (из п. 2.6.1.3) экстракта упаривают до водной фазы на роторном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 20 мл бидистиллированной воды и 30 мл гексана и воронку встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев отделяют гексановую фракцию, а водную фазу экстрагируют гексаном еще дважды (20 + 20 мл). Объединенный гексановый экстракт, содержащий фенамидон, пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, и затем упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

Водную фазу, оставшуюся после экстракции гексаном, трижды экстрагируют хлористым метиленом (30 + 20 + 20 мл) при встряхивании. Объединенный дихлорметановый экстракт, содержащий метаболиты фенамидона, сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 гексановых экстрактов растительного материала или почвы, содержащих фенамидон, количественно переносят тремя 1-мл порциями гексана в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 50 мл гексана, которые отбрасывают. Фенамидон элюируют 50 мл смеси гексан-хлористый метилен (9:1, по объему), отбрасывая первые 15 мл элюата и собирая последующие 35 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухие остатки экстрактов клубней картофеля и плодов томата растворяют в 2,5 мл, а экстракта почвы - в 1,25 мл подвижной фазы N 1 для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание фенамидона по п. 2.7.1. Сухие остатки экстрактов плодов огурца и лука дополнительно очищают на концентрирующем патроне Диапак-диол по п. 2.6.4.

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 дихлорметановых экстрактов растительного материала, содержащих метаболит RPA 405862, количественно переносят тремя 1-мл порциями смеси гексан-хлористый метилен (6:4, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 50 мл смеси гексан-хлористый метилен (6:4, по объему), которые отбрасывают. Метаболит элюируют 30 мл смеси гексан-хлористый метилен (1:1, по объему). Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухие остатки экстрактов клубней картофеля и плодов томата растворяют в 2,5 мл подвижной фазы N 2 для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание метаболита RPA 405862 по п. 2.7.2. Сухие остатки экстрактов плодов огурца и лука дополнительно очищают на концентрирующем патроне Диапак-диол по п. 2.6.4.

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенного по п. 2.6.2 дихлорметанового экстракта почвы, содержащего метаболит RPA 408056, количественно переносят тремя 1-мл порциями смеси гексан-хлористый метилен (7:3, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Колонку промывают 50 мл смеси гексан-хлористый метилен (6:4, по объему), которые отбрасывают. Метаболит элюируют 30 мл смеси гексан-хлористый метилен (1:1, по объему), отбрасывая первые 5 мл элюата и собирая последующие 25 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 мл подвижной фазы N 3 для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание метаболита RPA 408056 по п. 2.7.3.

Сухой остаток экстракта плодов огурца или лука (из п. 2.6.3), содержащий фенамидон, количественно переносят двумя 1-мл порциями смеси гексан-хлористый метилен (9:1, по объему) в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 2.5.6). Патрон промывают 10 мл смеси гексан-хлористый метилен (1:1, по объему) со скоростью 5 мл/мин., которые отбрасывают. Фенамидон элюируют 12 мл смеси гексан-хлористый метилен (1:9, по объему). Элюат упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 мл подвижной фазы N 1 для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание фенамидона по п. 2.7.1.

Сухой остаток экстракта плодов огурца или лука (из п. 2.6.3), содержащий метаболит RPA 405862, количественно переносят двумя 1-мл порциями смеси гексан-хлористый метилен (6:4, по объему) в подготовленный концентрирующий патрон Диапак-диол (п. 2.5.6). Патрон промывают 10 мл смеси гексан-хлористый метилен (4:6, по объему) со скоростью 5 мл/мин., которые отбрасывают. Метаболит RPA 405862 элюируют 8 мл смеси гексан-хлористый метилен (3:7, по объему) со скоростью 5 мл/мин. Элюат упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2,5 мл подвижной фазы N 2 для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание метаболита по п. 2.7.2.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Altex (США) или аналогичный.

Колонка стальная, длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Kromasil 100A-С18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (63:37, по объему).

Скорость потока элюента: 0,6 мл/мин.

Рабочая длина волны: 240 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 50 мкл.

Скорость протяжки ленты самописца: 15 см/ч.

Время удерживания фенамидона: около 6 мин.

Линейный диапазон детектирования: 2 - 20 нг.

Альтернативная неподвижная фаза: Диасорб 130-С16 Т.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (70:30, по объему).

Скорость потока элюента: 0,7 мл/мин.

Время удерживания фенамидона: 4 мин.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Altex (США).

Колонка стальная, длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Kromasil 100A-C18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (55:45, по объему).

Скорость потока элюента: 0,6 мл/мин.

Рабочая длина волны: 235 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 50 мкл.

Время выхода метаболита: около 4 мин.

Линейный диапазон детектирования: 2 - 20 нг.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Altex (США).

Колонка стальная, длиной 15 см, внутренним диаметром 4 мм, содержащая Kromasil 100A-C18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (30:70, по объему).

Скорость потока элюента: 0,6 мл/мин.

Рабочая длина волны: 240 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 50 мкл.

Время выхода метаболита: около 5,2 мин.

Линейный диапазон детектирования: 2 - 20 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,4 мкг/мл, разбавляют соответствующей подвижной фазой для ВЭЖХ.

Содержание фенамидона рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

А - концентрация стандартного раствора, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m - масса или объем анализируемой части образца, г или мл (для воды - 200 мл; для почвы и растительного материала - 5 г).

Содержание метаболитов фенамидона рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

А - концентрация стандартного раствора метаболита, мкг/мл;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m - масса или объем анализируемой части образца, г или мл.

При расчете содержания метаболитов RPA 405862 и RPA 408056 в эквивалентах фенамидона полученное значение X умножают соответственно на 1,11 и 1,41.

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

Дубовая Л.В.; Макеев А.М., к. биол. н.; Микитюк О.Д., к. биол. н.; Назарова Т.А., к. биол. н.

ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы, тел. 592-92-20.