"МУК 4.1.1232-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств трифлоксистробина в воде, почве, яблоках и его метаболита ЦГА 321113 в воде и почве газохроматографическим методом. Методические указания"
(утв. Минздравом России 16.03.2003)

1. Сборник подготовлен: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. А.В. Довгилевич) при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов). Разработчики методик контроля указаны в конце каждой из них.

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России.

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 16 марта 2003 г.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Сингента (Швейцария).

Торговое название: ЗАТО, ФЛИНТ.

Действующее вещество: трифлоксистробин (ЦГА 279202).

(Е,Е)-метоксиимино-{2-[1-(3-трифторметилфенил)-этилиденамино-оксиметил]-фенил)}уксусной кислоты метиловый эфир (ИЮПАК).

Структурная формула: (не приводится).

Трифлоксистробин токсичен для дафний, рыб и водорослей в лабораторном эксперименте.

Гигиенические нормативы:

ПДК в воде водоемов - 0,03 мг/куб. дм;

ОДК в почве - 0,2 мг/кг;

МДУ в яблоках и грушах - 0,1 мг/кг.

Основной метаболит трифлоксистробина: ЦГА 321113.

(Е,Е)-метоксиимино-{2-[1-(3-трифторметилфенил)-этилиденамино-оксиметил]-фенил}уксусная кислота (ИЮПАК).

Структурная формула: (не приводится).

Молекулярная масса: 394,4.

Белый порошок без запаха.

Другие физико-химические и токсикологические характеристики основного метаболита трифлоксистробина отсутствуют.

Область применения препарата. Трифлоксистробин - синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Вещество эффективно против широкого круга грибных патогенов хлебных злаков, овощных, кормовых, технических и плодовых культур. Обладает защитным и лечебно-профилактическим действием.

Проходит регистрационные испытания в России и странах СНГ под торговым названием Зато, ВДГ (500 г/кг) в яблоневых и грушевых садах в качестве средства борьбы с возбудителями мучнистой росы, парши, пятнистостей и болезней при хранении с нормой расхода препарата 0,10 - 0,15 кг/га при 4 - 6-кратной обработке (до и после цветения) за сезон с 10 - 14-дневными интервалами.

Трифлоксистробин - весьма лабильное вещество и при попадании в воду или почву достаточно быстро гидролизуется с образованием довольно устойчивого соединения - (Е,Е)-метоксиимино-{2-[1-(3-трифторметилфенил)-этилиденамино-оксиметил]-фенил}уксусной кислоты (ЦГА 321113). В яблоках трифлоксистробин разрушается слабо.

2.1.1. Принцип методики

Методика основана на газохроматографическом определении трифлоксистробина и его метаболита ЦГА 321113 (в виде метилового эфира) на неподвижной фазе OV-17 с использованием электронзахватного детектора (ДЭЗ) после экстракции препарата из воды гексаном, из почвы и яблок водным ацетоном, а метаболита из подкисленной воды хлористым метиленом и из почвы водным ацетоном при ультразвуковой обработке, предварительной очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, метилирования метаболита диазометаном до трифлоксистробина и окончательной очистки экстрактов на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании яблоневых садов.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979).

Отобранные пробы почвы и яблок хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более трех дней. Для длительного хранения пробы почвы доводят до воздушно-сухого состояния и хранят в холодильнике; пробы яблок хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 °С в течение 3 дней, при температуре -18 °С - в течение месяца.

Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, а яблоки измельчают.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока свежая порция кислоты не перестанет окрашиваться. Затем гексан последовательно промывают водой, 2%-м раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего его сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Этилацетат промывают равным объемом 5%-го раствора двууглекислого натрия, сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Диэтиловый эфир (1 л) предварительно встряхивают с 20 мл свежеприготовленного раствора железного купороса (30 г сульфата железа в 50 мл воды с добавлением 1,5 г концентрированной серной кислоты). Затем диэтиловый эфир последовательно промывают 0,5%-м раствором перманганата калия, 5%-м раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

2.5.2. Подготовка и кондиционирование колонки

Готовую насадку (3% OV-17 на Хромосорбе W(HP)) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 250 °С в течение 8 - 10 ч.

2.5.3. Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор трифлоксистробина с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,9% д.в., в толуоле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,025; 0,05; 0,125 и 0,25 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора трифлоксистробина соответствующим последовательным разбавлением толуолом. Рабочие растворы хранят в холодильнике не более 3 дней.

При изучении полноты открывания трифлоксистробина в модельных матрицах используются ацетоновые растворы вещества.

Основной стандартный раствор метаболита ЦГА 321113 с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,0% д.в., в ацетоне в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Из основного стандартного раствора метаболита готовят разбавлением ацетоном рабочие растворы с концентрациями 0,1; 0,5 и 2,5 мкг/мл, которые хранят в холодильнике не более 3 дней. Рабочие растворы используются при изучении полноты открывания метаболита в воде и почве. При расчете количества вводимого в матрицу метаболита учитывают соотношение молекулярных масс ЦГА 321113 и трифлоксистробина.

2.5.4. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 2 мкл рабочего стандартного раствора трифлоксистробина с концентрацией 0,025, 0,05, 0,125 и 0,25 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации трифлоксистробина в растворе в мкг/мл.

2.5.5. Приготовление раствора диазометана в эфире

В круглодонной колбе на 100 мл растворяют 5 г N-метил-N-нитрозо-п-толуолсульфонамида в 16 мл смеси диэтилового эфира и метанола (1:1). Колбу присоединяют к холодильнику, нижний конец которого снабжен алонжем с отводом, проходящим через резиновую пробку с отводом и погруженным в слой эфира (40 мл) на дне приемника. Приемник охлаждают смесью льда и соли. В капельницу помещают 15 мл 50%-го раствора едкого калия.

Реакцию начинают добавлением в реакционный сосуд раствора едкого калия по каплям, избегая бурного вскипания реакционной массы. Об окончании реакции судят по прекращению выделения диазометана в диэтиловый эфир.

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1,2 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и приливают около 10 мл гексана. Затем в колонку вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают последовательно 50 мл элюента N 2 и 30 мл элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения трифлоксистробина на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора трифлоксистробина с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 3 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента N 1, затем 70 мл элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл толуола и анализируют на содержание трифлоксистробина по п. 2.7.

Фракции, содержащие трифлоксистробин, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 4 мл толуола и вновь анализируют по п. 2.7. Рассчитывают содержание трифлоксистробина в элюате, определяют полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание. Профиль вымывания трифлоксистробина может меняться при использовании новой порции сорбента и растворителей.

2.6.1. Экстракция трифлоксистробина и метаболита ЦГА 321113 и очистка экстракта

2.6.1.1. Вода. В делительную воронку емкостью 250 мл помещают 100 мл предварительно отфильтрованной воды. Добавляют 20 мл гексана и встряхивают 1 мин. Верхний органический слой отделяют, собирая в грушевидную колбу на 100 мл. Водную фазу экстрагируют гексаном еще дважды порциями по 20 мл. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

Водную фазу, оставшуюся после экстракции гексаном, переносят в делительную воронку емкостью 250 мл, подкисляют 1 н HCl до рН 2 и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 20 мл. Объединенную органическую фазу, содержащую метаболит трифлоксистробина, пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают небольшими порциями в 20-мл грушевидной колбе на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. п. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.1.2. Яблоки. К навеске (25 г) измельченного материала добавляют 100 мл смеси ацетон - вода (2:1, по объему), гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. и суспензию перемешивают в течение 20 мин. на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу на 250 мл. Осадок на фильтре промывают 50 мл смеси ацетон - вода (2:1, по объему). Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 15 мл), эквивалентную 2,5 г растительного материала, и упаривают ее до водной фазы на роторном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 15 мл гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин. и после ее расслоения отделяют гексановый слой, который пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию водной фракции гексаном повторяют еще два раза (по 15 мл). Объединенный гексановый экстракт, содержащий трифлоксистробин, выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

2.6.1.3. Почва. Навеску (25 г) воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 100 мл смеси ацетон - вода (2:1, по объему) и помещают в ультразвуковую баню на 5 мин. К суспензии добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок на фильтре промывают 50 мл смеси ацетон - вода (2:1, по объему). Из объединенного экстракта отбирают аликвоту раствора (около 27 мл), эквивалентную 5 г почвы, и упаривают ее до водной фазы на роторном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 мл, приливают 15 мл бидистиллированной воды и 15 мл гексана. Смесь встряхивают в течение 1 мин. и после ее расслоения отделяют гексановую фракцию, которую пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию водной фракции гексаном повторяют еще два раза (по 15 мл). Объединенный гексановый экстракт, содержащий трифлоксистробин, выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 2.6.3.

Оставшуюся после обработки гексаном водную фазу подкисляют 1 н HCl до рН 2 и переносят в делительную воронку емкостью 100 мл. Приливают 10 мл хлористого метилена и воронку встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев отделяют дихлорметановую фракцию, которую пропускают через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 20 мл. Экстракцию водной фракции хлористым метиленом повторяют еще два раза (10 + 10 мл). Объединенный дихлорметановый экстракт, содержащий метаболит ЦГА 321113, выпаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. п. 2.6.2 и 2.6.3.

2.6.2. Метилирование

К сухим остаткам водного (из п. 2.6.1.1) и почвенного (из п. 2.6.1.3) экстрактов, содержащим метаболит ЦГА 321113, приливают соответственно 2 и 3 мл эфирного раствора диазометана (из п. 2.5.5), перемешивают, закрывают колбочки пробками и оставляют стоять в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем растворы упаривают досуха током воздуха.

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов воды, растительного материала и почвы (из п. п. 2.6.1.1, 2.6.1.2 и 2.6.1.3) или метилированных по п. 2.6.2 экстрактов воды и почвы, количественно переносят тремя 1-мл порциями элюента N 1 в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 40 мл элюента N 1, которые отбрасывают. Трифлоксистробин элюируют 60 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С. Сухие остатки экстрактов воды, почвы и яблок растворяют в 2 мл толуола и анализируют по п. 2.7.

Каждую анализируемую пробу вводят 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,25 мкг/мл, разбавляют толуолом.

Содержание трифлоксистробина рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95 "ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Павлова Н.Н., н.с., канд.биол.н.; Талалакина Т.Н., н.с., Чканикова Е.В., н.с., канд.мед.н.; Макеев А.М., зав. лаб., канд.биол.н. ВНИИ фитопатологии, 143050, Московская обл., п/о Большие Вяземы.