"МУК 4.1.1438-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств Трифлуралина в зеленой массе и зерне зерновых культур, в семенах и масле подсолнечника, сои и рапса методом газожидкостной хроматографии"
(утв. Минздравом России 24.06.2003)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (академик РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина), Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к.х.н. А.В. Довгилевич) при участии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Дау Агросаенсис.

Торговое название: Трефлан, гербитреф, дигермин, нитран, олитреф, флюран.

Название действующего вещества по ИСО: Трифлуралин.

Структурная формула (не приводится).

Название действующего вещества по ИЮПАК: альфа,альфа,альфа-трифлуоро-2,6-динитро-N,N-дипропил-ро-толуидин.

Молекулярная масса: 335,3.

Химически чистый Трифлуралин (98%) представляет собой кристаллическое вещество светло-желтого цвета.

Давление паров: 13,7 мПа при 25 °С.

Температура плавления: 48,5 - 49 °С.

Растворимость (при 25 °С): в ацетоне, хлороформе, ацетонитриле, толуоле, этилацетате > 1000; метаноле - 40; гексане - 67 г/л; в воде - 0,184 (при рН = 7); 0,221 (при рН = 5); 0,189 (при рН = 9) мг/л.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД (мг/кг/сут.) - 0,01;

ПДК в воде водоемов (мг/л) - 0,02;

ОДК в почве (мг/кг) - 0,1;

ПДК в воздухе рабочей зоны (мг/куб. м) - 3,0;

МДУ в подсолнечнике (семена), сое (семена), капусте, томатах, огурцах, табаке, чесноке, баклажанах, перце, луке - 0,5; подсолнечнике (масло), сое (масло) - 0,1; моркови товарной зрелости и петрушке пучковой зрелой - 0,01; хлопчатнике (семена и масло) и моркови пучковой зрелости - 0,25.

Область применения. Трифлуралин - почвенный гербицид избирательного действия, ингибирует рост проростков и корней растений.

Трифлуралин эффективно подавляет рост и развитие малолетних злаковых и некоторых двудольных сорных растений при довсходовом внесении в посевах подсолнечника, сои, рапса, хлопчатника и овощных культур.

Зарегистрирован в России под торговыми названиями Трефлан, 240 г/л к.э., Нитран, 300 г/л к.э., Трифлюрекс, 240 г/л к.э. и 480 г/л. к.э. в качестве гербицида для применения на сое, подсолнечнике, клещевине, рапсе, льне-долгунце, табаке, рассадной капусте и томатах, огурцах, баклажанах, перце, моркови, луке, чесноке, бобовых травах и лекарственных культурах с нормой расхода 2 - 6 л/га.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на экстракции Трифлуралина органическим растворителем, обработке экстракта концентрированной серной кислотой и последующей очистке экстракта перераспределением действующего вещества между несмешивающимися фазами для проб масла и семян масличных культур и очистке на колонке для зеленой массы и зерна зерновых культур. Определение Трифлуралина проводится с помощью газожидкостной хроматографии при использовании детектора по захвату электронов или постоянной рекомбинации ионов. Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2. Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании вышеупомянутых культур.

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

2.2.1. Реактивы, материалы и растворы

Трифлуралин, аналитический стандарт фирмы Дау Агросаенсис с содержанием д.в. 98%.

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Алюминия оксид Л 40/250 щелочной для колоночной хроматографии, ЧССР.

Ацетон, ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил, ТУ 6-09-3534-87.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Гелий очищенный марки "А", ТУ 51-940-80.

Метилен хлористый, ГОСТ 19433-88.

Насадка для набивной колонки: 5% ДС-550 на Хроматоне N-AW-DMCS (0,20 - 0,25 мм); фирма Хемапол, Чехия.

Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233-77.

2.2.2. Приборы, аппаратура, посуда

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73, или аналогичный.

Баня водяная, ТУ 46-22-603-75.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е, или аналогичные.

Воронки делительные на 250 мл, ГОСТ 25336-82.

Воронки для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Колбы мерные на 10, 25, 50, 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Колонка стеклянная для ГЖХ, длина 2 м, внутренний диаметр 0,3 см.

Колонка капиллярная для ГЖХ DB-1701, длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм, неподвижная фаза OV-17, фирма J & W Scietific, Fisons, США или аналогичная.

Колонки стеклянные для адсорбционной хроматографии длиной 30 см, диаметр 0,8 см.

Колбы конические на шлифе на 250 и 500 мл, ГОСТ 10394-72.

Колбы круглодонные на шлифе на 250 мл, ГОСТ 23932-79.

Концентраторы грушевидные НШ29 КГУ-100 (250), ГОСТ 10394-72.

Микрошприц на 10 мкл, ТУ Е-2.833.0.24.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Пипетки мерные на 1,0 и 5,0 мл, ГОСТ 20292-74.

Ротационный испаритель ИР-1М, ТУ 25-11-917-74.

Стаканы химические стеклянные, ГОСТ 6236-72.

Фильтры бумажные "Красная лента", ТУ 6-09-1678-86.

Хроматограф газовый "Цвет-500М" с детектором по захвату электронов и набивной колонкой или другой аналогичного типа.

Цилиндры мерные емкостью 25, 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74.

2.3.1. Подготовка и кондиционирование колонок для газожидкостной хроматографии

Готовую насадку засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом в соответствии с правилами. Колонку устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре на 20 °С ниже предельного значения для выбранной неподвижной фазы в течение 8 - 10 часов.

Капиллярную колонку с фазой DB 1701 устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 230 °С в течение 8 - 10 часов.

2.3.2. Приготовление стандартных растворов

Взвешивают 50 мг Трифлуралина в мерной колбе на 50 мл, растворяют навеску в гексане и доводят объем до метки гексаном (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/мл). Стандартный раствор N 1 можно хранить в холодильнике в течение 6 месяцев.

Методом последовательного разбавления готовят стандартные растворы Трифлуралина в гексане: с концентрацией 0,025; 0,05; 0,1 и 0,2 мкг/мл для построения калибровочного графика; с концентрацией 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мкг/мл для внесения в контрольный образец масла и с концентрацией 1,25; 2,5; 5,0; 10,0 мкг/мл для внесения в контрольный образец семян.

2.3.3. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно по 5 мкл каждого из полученных четырех растворов (для каждой концентрации делают не менее 3-х вводов), измеряют высоту или площадь пиков, рассчитывают среднее значение высоты пика или его площади для каждой концентрации и строят график зависимости высоты пика или площади от концентрации Трифлуралина в мкг/мл.

2.3.4. Подготовка колонки для очистки экстракта

Стеклянную колонку 30 х 0,8 см заполняют при легком постукивании щелочным оксидом алюминия на высоту 10 см.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы зеленой массы замораживают и хранят в запаянных полиэтиленовых пакетах в морозильнике при температуре -18 °С; пробы зерна и семян подсолнечника, сои, рапса подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре при комнатной температуре. Перед анализом пробы измельчают на лабораторной мельнице. Масло подсолнечника, сои и рапса хранят в закрытой таре в холодильнике.

2.5.1. Зеленая масса и зерно зерновых культур

Навеску зеленой массы и зерна 20 г помещают в коническую колбу с притертой пробкой, заливают 20 мл ацетонитрила, встряхивают в течение 0,5 часа и отфильтровывают под вакуумом. Экстракцию повторяют свежей порцией ацетонитрила 20 мл. Экстракты после фильтрации последовательно пропускают через бумажный фильтр и концентрируют до 0,5 - 1 мл на ротационном испарителе при температуре не выше 45 °С, затем до отсутствия ацетонитрила - в токе воздуха. Маслянистый остаток очищают колоночной хроматографией. До внесения экстракта колонку с оксидом алюминия промывают 10 мл гексана. Остаток экстракта растворяют в 1 мл гексана и переносят в колонку. Колбу обмывают 3 раза 1 мл гексана, смывы также переносят в колонку. Растворитель отсасывают под вакуумом, трефлан элюируют в концентратор 40 мл гексана со скоростью 60 - 80 капель в минуту. Элюат концентрируют до 0,5 - 10 мл, и 2 мкл раствора вводят в хроматограф.

2.5.2. Семена подсолнечника, сои и рапса

Навеску семян подсолнечника, сои или рапса массой 5 г помещают в колбу объемом 250 мл, добавляют 50 мл ацетона и встряхивают смесь на аппарате для встряхивания 0,5 часа. Затем экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу емкостью 250 мл. Экстракцию повторяют еще два раза, используя 50 мл ацетона и встряхивая пробу каждый раз в течение 0,5 часа. Экстракты отфильтровывают в ту же колбу. Объем экстракта доводят до 150 мл, приливая в колбу ацетон. Содержимое колбы перемешивают, отбирают аликвоту 30 мл (1/5 часть пробы), помещают ее в концентратор емкостью 100 мл и упаривают пробу на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 45 °С.

Остаток в концентраторе разводят в 20 мл гексана, переносят гексан в делительную воронку емкостью 250 мл, обмывают концентратор еще раз 20 мл гексана. Добавляют в делительную воронку 50 мл ацетонитрила и экстрагируют Трифлуралин, встряхивая делительную воронку в течение 1 - 2 минут. После разделения слоев нижний слой (ацетонитрил) сливают в концентратор емкостью 250 мл. Экстракцию ацетонитрилом повторяют еще два раза порциями по 50 мл. Гексан отбрасывают. Объединенный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 45 °С до объема 5 мл.

Добавляют в концентратор 5 мл концентрированной серной кислоты и перемешивают содержимое концентратора. Приливают в концентратор 50 мл дистиллированной воды, еще раз перемешивают содержимое, обмывая стенки концентратора, и переносят пробу в чистую делительную воронку. Концентратор ополаскивают 50 мл дистиллированной воды, которую переливают в ту же делительную воронку.

*В воронку добавляют 30 мл метиленхлорида и экстрагируют Трифлуралин из водной фазы, встряхивая воронку в течение 1 - 2 минут. После разделения фаз нижний слой метиленхлорида сливают в концентратор через безводный сульфат натрия. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 30 мл метиленхлорида. Объединенные экстракты метиленхлорида упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 45 °С. Сухой остаток в концентраторе разводят в 10 мл гексана, тщательно обмывают стенки концентратора и вводят в хроматограф 1 мкл пробы.

2.5.3. Масло подсолнечника, сои и рапса

Навеску масла 10 г помещают в стеклянный мерный стакан емкостью 100 мл, разводят масло гексаном до объема 100 мл. Отбирают мерным цилиндром аликвоту пробы 20 мл (1/5 пробы) и переносят ее в делительную воронку емкостью 250 мл. Цилиндр ополаскивают 20 мл гексана, гексан помещают в ту же воронку. Экстрагируют Трифлуралин из гексана ацетонитрилом четыре раза порциями по 30 мл, встряхивая делительную воронку в течение 1 - 2 минут. Экстракты ацетонитрила собирают в мерный стакан емкостью 200 мл. Затем объединенный экстракт переносят в чистую делительную воронку емкостью 250 мл и промывают его гексаном два раза, используя каждый раз по 20 мл гексана. Гексан отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт сливают в концентратор емкостью 250 мл и упаривают на ротационном вакуумном испарителе до маслянистого остатка.

К остатку в концентраторе приливают поочередно: 5 мл концентрированной серной кислоты, 5 мл ацетонитрила, 100 мл дистиллированной воды, перемешивая каждый раз содержимое концентратора. После этого пробу из концентратора переносят в делительную воронку и проводят экстракцию Трифлуралина метиленхлоридом по схеме, приведенной в разделе 2.5.2, абзац 4 (*).

Очищенную пробу разводят в 10 мл гексана и вводят в хроматограф 1 мкл.

2.6.1. Условия хроматографирования

2.6.1.1. Для определения Трифлуралина в зеленой массе и зерне зерновых культур на набивной колонке

Хроматограф газовый с детектором по захвату электронов.

Неподвижная фаза - 5% ДС-550 на Хроматоне N-AW-DMCS (0,20 - 0,25 мм).

Колонка стеклянная, спиральная, длина 2 м, внутренний диаметр 3 мм.

Скорость газа-носителя - азота - 40 мл/мин.

Объем, вводимый в испаритель, - 2 мкл.

Линейность детектирования - 0,1 - 5,0 нг.

Время удерживания - 2,11 мин.

Скорость ленты - 200 мм/час.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза, измеряют высоты пиков, вычисляют среднее значение высоты. По градуировочному графику и высоте пика находят количество Трифлуралина в анализируемом объеме экстракта.

2.6.1.2. Для определения Трифлуралина в семенах и масле подсолнечника, сои и рапса на капиллярной колонке

Колонка капиллярная кварцевая DB - 1701, длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, жидкая фаза OV-17.

Режим работы - Splitless.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 140 °С, выдержка 3 минуты; нагрев колонки по 10 градусов в минуту до температуры 170 °С, выдержка 15 минут, нагрев колонки по 30 градусов в минуту до 260 °С, выдержка 3 минуты.

Температура испарителя - 260 °С, детектора - 320 °С.

Регулятор расхода гелия: тип регулятора - РРГ-11; режим - Splitless; минимальный расход гелия - 20 мл/мин.; длительность сброса - 5 мин.

Газ 1 - гелий, расход - 0,5 мл/мин., линейная скорость - 21 см/сек., давление на входе - 27,34 кПа.

Газ 2 - гелий (продувка испарителя), сброс 1:100, начало сброса - 5 сек., расход - 50 мл/мин.

Газ 3 - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 35 мл/мин.

Абсолютное время удерживания Трифлуралина - 9 мин. 22 сек. - 9 мин. 27 сек.

Объем вводимой пробы - 1 мкл.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,01 - 0,2 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика. Образцы, дающие пики больше чем стандартный раствор с концентрацией 0,2 мкг/мл, разбавляют.

2.6.2. Обработка результатов анализов

Содержание Трифлуралина в пробах зеленой массы, зерна, семян и масла подсолнечника, сои и рапса при анализе методом ГЖХ рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

Определение Трефлана в зеленой массе и зерне зерновых культур:

Юркова Р.Г., Пиленкова И.И., ВНИТИГ, г. Уфа.

Определение Трефлана в семенах и масле подсолнечника, сои и рапса:

Калинин В.А., профессор, канд. с.-х. наук; Калинина Т.С., канд. с.-х. наук; Фролова Н.С., ст. инженер. Московская сельскохозяйственная академия имени К.А. Тимирязева, 127550, Москва, Тимирязевский пр., 2, кафедра химических средств защиты растений. Телефон: 976-02-20, факс 976-43-26. E-mail: tlmaa@online.ru.