"МУК 4.1.1228-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств спироксамина в воде, почве, зерне, зеленой массе и соломе злаковых культур, винограде методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Минздравом России 16.03.2003)

1. Сборник подготовлен: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин) при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов). Разработчики методик контроля указаны в конце каждой из них.

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России.

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 16 марта 2003 года.

4. Введены впервые.

Название действующего вещества: спироксамин (ИСО).

Торговое название: Фалькон.

Фирма-производитель: Байер, Германия.

8-третбутил-1,4-диоксаспиро[4,5]декан-2-ил-метил(этил)(пропил)-амин (IUPAC).

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 297,5.

Существует в виде смеси диастереоизомеров 1:2 = 49 - 56%:51 - 44%. Ниже приведены (если не указано особо) свойства для смеси диастереоизомеров.

Вязкая жидкость бледно-желтого цвета без запаха. Температура кипения 120 °С при 6,7 Ра. Давление паров 9,7 mРа (20 °С) и 17 mРа (25 °С) для изомеров 1 и 2, соответственно.

Хорошо растворим в органических растворителях. Растворимость при 20 °С в ацетоне, ацетонитриле, дихлорметане, гексане, пропаноле, толуоле более 200 г/л. Растворимость в воде при 20 °С (г/л): при рН 3 - > 200; при рН 7 - 0,470 (изомер 1) и 0,340 (изомер 2); при рН 9 - 0,014 (изомер 1) и 0,010 (изомер 2).

Гигиенические нормативы для спироксамина:

ПДК в почве (мг/кг) - 0,4

ОДУ в воде водоемов (мг/куб. дм) - 0,0025

МДУ в зерне хлебных злаков (мг/кг) - 0,2

ВМДУ в винограде - 0,1

Область применения: Фалькон, КЭ - комбинированный фунгицид широкого спектра действия на посевах зерновых культур и виноградниках, содержит спироксамина 250 мг/л + тебуконазола 167 г/л + триадименола 43 г/л.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на извлечении спироксамина из проб растворителем с последующей очисткой перераспределением между двумя не смешивающимися жидкостями и на колонке с окисью алюминия или флорисилом. Количественное определение проводят методом газожидкостной хроматографии с термоионным детектором.

2.1.2. Избирательность метода

Избирательность метода обеспечивается очисткой экстрактов анализируемых проб, сочетанием селективного детектора и условий хроматографирования. В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых для борьбы с сорной растительностью, защиты овощных и масличных культур от вредителей и болезней (хлор и фосфорорганические пестициды, амиды, тио- и дитиокарбаматы, синтетические пиретроиды).

2.1.3. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 - 2.

Минимально детектируемое количество спироксамина для хроматографа "Цвет" серии 500 с термоионным детектором - 2,5 нг, для импортных хроматографов (HP 5840, PYE UNICAM 204) - 0,5 нг.

Граница суммарной погрешности измерения - 12%.

Линейный диапазон детектирования ("Цвет-550") - 2,5 - 25 нг, для импортных хроматографов - 1 - 20 нг.

2.4.1. Подготовка и кондиционирование колонок для газожидкостной хроматографии

Готовую насадку (5% PS-400 или 3% OV-17 на хромосорбе 750, или 5% SE-30 на хроматоне N, или 5% SP-2100 на хромосорбе W) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостат хроматографа, не подсоединяя к детектору, и выдерживают при температуре 250 °С в токе газа-носителя в течение 10 - 12 ч.

2.4.2. Подготовка растворителей и приготовление растворов

Растворители, используемые для анализа, специальной подготовки не требуют.

Рекомендуется проверить чистоту применяемых растворителей. Для этого 100 мл растворителя помещают в круглодонную колбу, испаряют при помощи вакуумного ротационного испарителя при температуре 40 °С досуха, обмывают стенки колбы 1 мл ацетона и хроматографируют по п. 2.6.1. При обнаружении примесей, которые могут мешать определению, растворители очищают общепринятыми методами.

1 М раствор NaOH. Навеску 40 г гидроокиси натрия помещают в мерную колбу на 1 л. Добавляют в колбу 200 - 300 мл дистиллированной воды. Перемешивают содержимое колбы до полного растворения гидроокиси натрия. После охлаждения раствора до комнатной температуры доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Содержимое колбы перемешивают.

0,25 М раствор NaOH. Навеску 5 г гидроксида натрия помещают в мерную колбу на 0,5 л, добавляют 200 мл дистиллированной воды и перемешивают до полного растворения. После охлаждения раствора доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Содержимое колбы перемешивают.

2.4.3. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Взвешивают 100 мг аналитического стандарта спироксамина, переносят в мерную колбу объемом 100 мл, доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор с концентрацией спироксамина 1 мг/мл).

Градуировочные растворы с концентрациями 1; 2; 2,5; 5; 10; 25 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему.

Стандартный раствор устойчив при хранении в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 3 месяцев, градуировочные растворы - 1 месяц.

Для построения градуировочного графика - зависимости высоты (мм) или площади (мв х с) пика на хроматограмме от концентрации раствора (мкг/мл), в хроматограф вводят по 1 - 2 мкл градуировочных растворов (не менее 3 параллельных определений для каждого раствора).

Градуировочные растворы используют также для внесения в контрольные образцы с целью определения полноты извлечения спироксамина.

2.4.4. Подготовка окиси алюминия и хроматографических колонок для очистки экстрактов

Сорбент прокаливают в муфельной печи при температуре 350 °С в течение не менее 16 ч, остужают в эксикаторе до комнатной температуры и помещают в плоскодонную колбу. Добавляют 3% дистиллированной воды (по весу), закрывают колбу пробкой и энергично встряхивают сначала в течение 5 мин. вручную, а затем два часа на механическом встряхивателе. Колбу оставляют на 48 ч, периодически, через каждые 2 ч, в течение рабочего дня энергично встряхивая ее содержимое 5 - 10 мин.

В нижнюю часть колонки для очистки экстрактов помещают тампон из стекловаты. Заполняют колонку на 1/4 этилацетатом. Навеску сорбента (14 г) смешивают в химическом стакане с 15 - 20 мл этилацетата. Заполняют колонку полученной суспензией. Дополнительно в верхнюю часть колонки над сорбентом помещают слой безводного сульфата натрия (1 - 1,5 г). Уровень растворителя над слоем сульфата натрия должен составлять 10 - 15 мм. Пропускают через колонку 20 мл этилацетата.

Для каждой приготовленной партии сорбента проверяют объем удерживания спироксамина на хроматографической колонке. Для этого уровень растворителя в хроматографической колонке понижают почти до верхнего слоя сорбента. При помощи стеклянной или автоматической пипетки вносят 1 мл стандартного раствора спироксамина с концентрацией 10 мкг/мл. Дают раствору впитаться, приоткрывая кран колонки и осторожно сливая растворитель, так чтобы слой растворителя над верхним краем сорбента составлял ~ 0,5 см. Элюируют спироксамин из колонки этилацетатом со скоростью 2 мл/мин., отбирая фракции объемом 10 мл в цилиндры на 10 мл. Всего отбирают 6 - 7 фракций. Из цилиндров растворы переливают в круглодонные колбы на 50 мл (каждую фракцию помещают в отдельную колбу). Каждый цилиндр ополаскивают 1 - 2 мл этилацетата, который также вносят в соответствующую колбу. Выпаривают растворитель досуха, сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона, тщательно обмывая стенки колб, и хроматографируют. Суммарный объем первых фракций, в которых не обнаружен спироксамин, представляет собой объем растворителя, который необходимо отбросить при элюировании спироксамина из колонки при очистке проб. Суммарный объем фракций, в которых обнаружен спироксамин, представляет собой объем растворителя, который необходим для элюирования спироксамина из колонки при очистке проб.

Для очистки проб винограда (ягоды, сок) используют хроматографические колонки длиной 300 мм и диаметром 12 мм. В нижнюю часть колонки помещают тампон из стекловаты, заполняют колонку флорисилом (4 г) и дополнительно в верхнюю часть колонки вносят слой безводного сульфата натрия высотой 10 мм. После этого колонку промывают 10 мл чистого н-гексана.

2.4.5. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С16 (0,6 г) для очистки виноградного сока

Патрон Диапак С16 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, подсоединенного к водоструйному насосу. Сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Льюер объемом не менее 10 мл (используется как емкость для элюентов). Для активации и кондиционирования патрона через него последовательно пропускают 5 мл хлористого метилена, 10 мл ацетона, 10 мл 0,1 н NaOH. Элюат отбрасывают. Скорость потока через патрон не должна превышать 1 - 2 мл/мин. После кондиционирования патрона нельзя допускать высыхания поверхности картриджа и попадания в него пузырьков воздуха. После кондиционирования патрон сразу же используется для работы или герметично закрывается прилагаемыми к нему заглушками с обоих концов для последующего использования.

2.4.6. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения производится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", утвержденными заместителем Главного государственного санитарного врача СССР 21 августа 1979 г. N 2051-79.

Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в стеклянной или бумажной таре при комнатной температуре. Замороженные образцы зеленой массы и винограда хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °С. Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторных мельницах.

Для длительного хранения пробы замораживаются и хранятся при температуре -18 °С.

2.6.1. Экстракция

Вода. Пробу анализируемой воды (250 мл) помещают в делительную воронку на 250 мл, подщелачивают 1 н NaOH до рН 7,5 - 8,5, добавляют 30 мл хлороформа. Воронку встряхивают 2 мин., дают разделиться слоям. После полного разделения слоев хлороформ (нижний слой) сливают в круглодонную колбу на 250 мл, фильтруя через фильтр "белая лента" со слоем безводного сульфата натрия. Повторяют экстракцию еще дважды, каждый раз используя по 30 мл хлороформа. Фильтр с сульфатом натрия промывают 20 мл хлороформа. Воду отбрасывают. Объединенный экстракт выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 - 3 мл этилового спирта и выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Операцию с этанолом повторяют еще дважды. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона и хроматографируют по п. 2.7.1.

В случае наличия на хроматограммах проб, мешающих определению коэкстрактивных соединений проводят дополнительную очистку экстракта на колонке с окисью алюминия по п. 2.6.3.

Зерно, зеленая масса и солома. Навеску растительного материала (20 г) помещают в плоскодонную колбу на 500 мл, добавляют 150 мл ацетона. Колбу с пробой встряхивают на механическом встряхиватели в течение 30 мин. Содержимое колбы фильтруют в стакан методом декантации через фильтр "белая лента" в круглодонную колбу на 500 мл. Экстракцию повторяют при тех же условиях. Колбу с пробой и осадок на фильтре промывают 50 мл ацетона. Объединенный экстракт упаривают до объема 3 - 4 мл на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 45 °С. Далее проводят очистку экстракта по п. 2.6.2.

Виноград. Ягоды винограда. Навеску ягод винограда 50 г измельчают, помещают в коническую колбу на 250 мл, добавляют 100 мл раствора ацетон-хлористый метилен в соотношении 1:1 и экстрагируют спироксамин в ультразвуковой ванне 10 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр (белая лента). К оставшемуся остатку добавляют 50 мл смеси ацетон-хлористый метилен и повторяют экстракцию в ультразвуковой ванне еще 10 мин. Экстракт отфильтровывают. Объединенный фильтрат помещают в делительную воронку на 500 мл и производят очистку по п. 2.6.2.

Виноградный сок. 50 мл сока помещают в плоскодонную колбу на 250 мл, добавляют 70 мл смеси ацетон-хлористый метилен (1:1) и затем 10 мл 1 М раствора NaOH (до рН 8 - 9). Колбу помещают в ультразвуковую ванну и экстрагируют спироксамин в течение 10 мин. Затем содержимое колбы переносят в делительную воронку на 500 мл, дают жидкости полностью расслоиться и нижнюю органическую фазу сливают в круглодонную колбу через слой безводного сернокислого натрия (30 г). С верхним водно-щелочным слоем (рН 8 - 9) повторяют экстракцию 50 мл той же смеси ацетон-хлористый метилен (1:1) в течение 10 мин. в ультразвуковой ванне. После расслоения жидкостей в делительной воронке нижний органический слой сливают в ту же круглодонную колбу через слой безводного сернокислого натрия, который затем промывают 10 мл той же смеси. Водно-щелочной слой отбрасывают. Объединенный органический экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона. Дополнительная очистка на колонке с флорисилом осуществляется так же, как для ягод винограда или используют патроны Диапак С16 (п. 2.6.4).

2.6.2. Очистка экстрактов

Почва. Экстракт подщелачивают 1 н NaOH до рН 7,5 - 8,5 и помещают в делительную воронку на 500 мл. Колбу ополаскивают 30 мл хлороформа, который также переливают в делительную воронку. Воронку встряхивают 2 мин., дают разделиться слоям. После полного разделения слоев хлороформ (нижний слой) сливают в круглодонную колбу на 250 мл, фильтруя через фильтр "белая лента" со слоем безводного сульфата натрия. Повторяют экстракцию еще дважды, каждый раз используя по 30 мл хлороформа. Фильтр с сульфатом натрия промывают 20 мл хлороформа. Водный слой отбрасывают. Объединенный экстракт выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 - 3 мл этилового спирта и выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Операцию с этанолом повторяют еще дважды. Далее проводят очистку экстракта на колонке с окисью алюминия по п. 2.6.3.

При наличии на хроматограммах проб мешающих определению коэкстрактивных соединений проводят дополнительную очистку экстракта на колонке с окисью алюминия по п. 2.6.3.

Виноград. В делительную воронку с объединенным фильтратом добавляют 40 - 50 мл 0,25 М раствора NaOH (до рН 8 - 9). Воронку встряхивают в течение 3 мин. Нижнюю органическую фазу сливают через слой безводного сернокислого натрия (30 г) в круглодонную колбу. Верхний водный слой (рН 8 - 9) экстрагируют 50 мл хлористого метилена, встряхивая воронку в течение 3 мин. После полного расслоения жидкостей, органическую фазу сливают в ту же круглодонную колбу через слой безводного сернокислого натрия (30 г). Водный слой отбрасывают, а объединенный органический экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона и далее проводят очистку на колонке с флорисилом по п. 2.6.3.

2.6.3. Очистка экстрактов на колонке с окисью алюминия и флористом

Вода, почва, зеленая масса, солома, зерно. Растворяют сухой остаток в 1 мл ацетона. Перед внесением пробы уровень растворителя в колонке понижают почти до верхнего края сорбента. Пипеткой количественно вносят анализируемую пробу в колонку и дают ей впитаться. Обмывают стенки колбы 1 мл ацетона, который также вносят в колонку. Дают пробе впитаться, приоткрывая кран колонки и внимательно следя за тем, чтобы уровень жидкости в колонке не опускался ниже верхнего слоя сорбента. Элюируют спироксамин из колонки, используя 40 мл этилацетата со скоростью 2 мл/мин. Первые 10 мл элюата отбрасывают, а последующие 30 мл собирают в круглодонную колбу на 100 мл. Растворитель выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Экстракт растворяют в 1 - 2 мл ацетона и хроматографируют по п. 2.6.1.

Виноград (ягоды, сок). Ацетоновый раствор количественно переносят в колонку с флорисилом. Стенки колбы обмывают 1 мл ацетона и также вносят в хроматографическую колонку. После впитывания раствора флорисилом элюируют спироксамин из колонки, используя 50 мл смеси ацетон-гексан в соотношении 7:3. Первые 10 мл элюата отбрасывают, а последующие 40 мл собирают в круглодонную колбу на 100 мл. Растворитель выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона и хроматографируют, дозируя в хроматограф 1 - 2 мкл раствора.

2.6.4. Альтернативный вариант очистки виноградного сока с помощью патрона Диапак С16

К 50 мл виноградного сока добавляют по каплям 1 н раствор NaOH до рН 9 (контроль по индикаторной бумаге). Затем виноградный сок фильтруют в колбу на 100 мл через стеклянную воронку с ватным тампоном, предварительно промытым ацетоном. Остаток с ваты смывают 5 мл ацетона. Объединенный фильтрат пропускают через предварительно откондиционированный патрон Диапак С16 со скоростью 1 - 2 мл/мин. По окончании пропускания образца остаток раствора выдувается с картриджа током азота в течение 30 мин. Элюируют спироксамин с патрона 6 мл хлористого метилена, добавляя его порциями по 1 мл. Необходимо, чтобы первая порция элюента задержалась в патроне 1 - 2 мин. для установления равновесия в системе и более полного извлечения спироксамина. Элюат упаривают досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона и хроматографируют.

Газовый хроматограф, оснащенный термоионным детектором (Цвет 500, НР-5840, PYE UNICAM 204 или аналогичные). Газ-носитель - гелий или азот высокой чистоты.

Условия хроматографирования для импортируемых хроматографов HP 5840 и PYE UNICAM 204 приведены в таблице:

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание спироксамина в пробах рассчитывают по формуле:

Содержание остаточных количеств спироксамина в анализируемой пробе вычисляют как среднее из 3 параллельных определений.

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, сжатыми газами, а также инструкций по эксплуатации газового хроматографа и электрооборудования.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ "Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Определение спироксамина в воде, почве, зеленой массе, зерне и соломе злаковых культур: Басова Ю.Г., Сабуров Г.Г., Андреева М.В., Маслаков С.Е. Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт лесного хозяйства.

Определение спироксамина в винограде: Остроухова О.К., Блинова Т.Ф., Цибульская И.А., Долженко В.И. Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений (ВИЗР).