"МУК 4.1.1149-02. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Цимоксанила в воде, почве, зеленой массе растений, клубнях картофеля, ягодах винограда, плодах огурца хроматографическими методами. Методические указания"
(утв. Минздравом России)

1. Методические указания подготовлены: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. Довгилевич А.В.); Всероссийским НИИ фитопатологии (А.М. Макеев и др.); Всероссийским НИИ защиты растений (В.И. Долженко и др.); Санкт-Петербургским НИИ лесного хозяйства (Маслаков С.Е., Л.В. Григорьева и др.), при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России.

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Фирма-производитель: Дюпон, США.

Торговое название: Курзат.

Название действующего вещества по ИСО: Цимоксанил.

Название действующего вещества по IUPAC: 1-(2-циано-2-мето-ксииминоацетил)-3-этилмочевина.

Химически чистый Цимоксанил представляет собой бесцветное кристаллическое вещество.

Давление паров: 0,15 мПа при 20 °C.

Температура плавления: 160 - 161 °C.

Коэффициент распределения н-октанол - вода lоg Р: 0,59 (pH 5); 0,67 (pH 7).

Растворимость в воде составляет 890 мг/л. Растворимость в органических растворителях (г/л): ацетон - 62,4; ацетонитрил - 57, бензол - 2, гексан - 1,85, диметилформамид - 185, метанол - 22,9, метиленхлорид - 133, н-октанол - 1,43, толуол - 5,29, хлороформ - 103, этилацетат - 28.

В почве Цимоксанил быстро разрушается под действием микроорганизмов. В тепличных условиях период полураспада составляет около трех дней, в полевых условиях - от 7 до 14 дней. Миграция по почвенному профилю слабая.

В растениях соединение быстро разрушается до нетоксичных метаболитов. Остатки Цимоксанила в клубнях картофеля не обнаруживаются. В ягодах винограда, по данным фирмы Дюпон, остатки составляли ниже 0,2 мг/кг при обработке за несколько дней до уборки.

Краткая гигиеническая характеристика

В РФ установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,02 мг/кг массы человека;

ОДК в почве - 0,04 мг/кг;

ПДК в воде водоемов - 0,3 мг/куб. дм;

МДУ в картофеле и огурцах - 0,05 мг/кг;

ВМДУ в винограде - 0,1 мг/кг.

Цимоксанил - контактный фунгицид с местным системным эффектом, обладающий защитным и лечащим действием. Высокоактивен против грибов, вызывающих фитофтороз и пероноспороз, не действует на возбудителей настоящей мучнистой росы. Длительность защитного действия составляет 4 - 6 дней, поэтому рекомендуется его использование в смеси с другими фунгицидами системного и защитного контактного действия.

Зарегистрирован в России под названием Танос, диспергируемые в воде гранулы, 50% (25% Фамоксадона + 25% Цимоксанила) на картофеле с нормой расхода 0,6 кг/га, трехкратная обработка за сезон.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении Цимоксанила с помощью газожидкостной хроматографии при использовании термоионного детектора на неподвижной фазе ХЕ-60 после экстракции органическим растворителем, очистки экстракта путем перевода действующего вещества в водную фазу и повторной экстракции органическим растворителем.

Метод ТСХ основан на извлечении Цимоксанила из анализируемого объекта этилацетатом, очистке экстракта на колонке с оксидом алюминия или сублимацией в вакууме и определении тонкослойной хроматографией.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки (ГЖХ) или визуального сравнения величин пятен стандарта и пробы.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

2.1.3. Избирательность метода

В предлагаемых условиях методы специфичны в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании винограда, огурцов и картофеля (дитиокарбаматы, хлор- и фосфорорганические соединения, синтетические пиретроиды).

2.2.1. Реактивы, материалы и растворы

2.2.2. Приборы, оборудование, посуда

2.3.1. Подготовка и кондиционирование колонки для газожидкостной хроматографии

Готовую насадку (5% ХЕ-60 на Хроматоне N-AW) засыпают в стеклянную колонку, уплотняют под вакуумом, колонку устанавливают в термостате хроматографа, не подсоединяя к детектору, и стабилизируют в токе азота при температуре 230 °C в течение 8 - 10 часов. Для достижения предела обнаружения проводят тренировку колонки в течение 48 - 72 часов, вводя каждый час по 3 мкл стандартного раствора Цимоксанила с концентрацией 10 мкг/мл.

2.3.2. Приготовление колонки с оксидом алюминия

В стеклянную хроматографическую колонку помещают ватный тампон, затем суспензию 4 г оксида алюминия в 15 мл хлороформа (при открытом кране колонки). Когда сорбент заполнит всю колонку, дают возможность стечь избытку растворителя, оставляя маленький слой его (0,2 - 0,3 см) на поверхности оксида алюминия. Кран закрывают. Колонка готова к работе.

2.3.3. Подготовка хлорирующей камеры

2.3.4. Подготовка хроматографических камер

В хроматографические камеры за один час до начала хроматографирования наливают хлороформ или смесь растворителей: гексан-ацетон (3:2) для насыщения камеры парами подвижных растворителей. Объем подвижного растворителя в камере должен находиться по высоте не выше, чем 0,7 - 1 см от уровня дна камеры.

2.3.5. Приготовление проявляющего реагента

Растворяют в мерной колбе на 500 мл 0,16 г о-толидина в 30 мл ледяной уксусной кислоты, добавляют дистиллированной воды примерно до 300 мл и прибавляют 1 г иодида калия. При помешивании растворяют иодид калия и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор хранят в темной склянке. Годен к употреблению в течение длительного времени.

2.3.6. Приготовление стандартных растворов

Взвешивают 50 мг Цимоксанила в мерной колбе на 50 мл, растворяют навеску в этилацетате и доводят объем до метки этилацетатом (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/мл).

Стандартный раствор N 1 можно хранить в холодильнике в течение 1 месяца. Методом последовательного разбавления готовят стандартные растворы Цимоксанила в этилацетате с концентрацией 10,0; 5,0; 2,5; 2,0 и 1,0 мкг/мл для построения калибровочного графика.

Для ТСХ приготавливают стандартные растворы Цимоксанила в ацетоне с концентрацией 100 и 10 мкг/мл.

2.3.7. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно по 3 раза по 2,5 мкл каждого из полученных пяти растворов, измеряют высоту или площадь пиков, рассчитывают среднее значение высоты пика или его площади для каждой концентрации и строят график зависимости высоты пика или площади от концентрации Цимоксанила мкг/мл.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °C. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Растительные образцы замораживаются (лучше жидким азотом) и хранятся в холодильнике при -10 °C в течение 1 месяца, предварительно определяется содержание влаги.

Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 0,1 мм, растительный материал режут ножом на кусочки длиной не более 0,5 см, остальные объекты измельчают на гомогенизаторе или на терке.

2.5.1. Вода. ТСХ

500 мл воды помещают в делительную воронку вместимостью 1000 мл, добавляют около 5 г хлорида натрия и 50 мл хлороформа. Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают. После разделения слоев нижний хлороформный слой сливают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию Цимоксанила повторяют еще дважды тем же количеством растворителя. Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (10 - 12 г). Раствор сливают через бумажный фильтр порциями в грушевидную колбочку вместимостью 50 мл. Концентрируют каждую порцию с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 2 мл. Последнюю порцию растворителя отгоняют полностью. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл гексана, колбочку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно обмывают растворителем.

2.5.2. Почва

2.5.2.1. ГЖХ. Навеску 50 г воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу объемом 250 мл, равномерно смачивают 10 мл воды и перемешивают. Добавляют в колбу 100 мл ацетона, встряхивают на приборе для встряхивания 1 час. После выдерживания в течение 10 минут экстракт фильтруют методом декантации через фильтр "красная лента" в концентратор. Повторяют экстракцию дважды: 50 мл ацетона в течение 0,5 часа и 50 мл ацетона - 15 минут. Экстракты объединяют, добавляют в концентратор 20 мл дистиллированной воды и упаривают ацетон на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 50 °C. Далее экстракт очищают по следующей схеме.

2.5.2.1.1. Очистка экстракта. Водный экстракт помещают в делительную воронку, ополаскивая концентратор 30 мл воды. Добавляют в воронку 20 мл хлороформа и интенсивно встряхивают 2 минуты. После разделения фаз нижний хлороформный слой собирают в стакан объемом 100 мл. Экстракцию повторяют дважды, используя по 20 мл хлороформа, объединенный хлороформный экстракт помещают в чистую делительную воронку, добавляют туда 10 мл 0,1 н соляной кислоты и интенсивно встряхивают 2 минуты. После разделения фаз нижний хлороформовый слой собирают в конический концентратор, пропуская его через слой безводного серно-кислого натрия. Осушитель ополаскивают 10 мл хлороформа. Экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 50 °C. Последние капли растворителя удаляют током воздуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл этилацетата и вводят в хроматограф 2,5 мкл пробы.

2.5.2.2. Почва ТСХ. К 10 г почвы, растертой в фарфоровой ступке, добавляют 2 мл дистиллированной воды. Почву тщательно увлажняют. Экстракцию Цимоксанила проводят этилацетатом три раза порциями по 50 мл при механическом встряхивании колбы в течение 30 мин. Дальнейшее определение проводят по схеме, описанной ниже с любой очисткой.

Сухой остаток с помощью 2 - 3 мл хлороформа количественно переносится на колонку с оксидом алюминия. Каждый раз дают возможность раствору впитаться в сорбент, открывая кран колонки, но не допуская ее осушения: Во всех случаях над сорбентом должен оставаться небольшой слой растворителя (2 - 3 мм). Цимоксанил элюируют с колонки 10 мл хлороформа, собирая элюат в круглодонную колбу. Элюирование проводят со скоростью 1 кап./с. Равномерность потока растворителя обеспечивается вакуумом, регулируемым водоструйным насосом. Из приемной колбы вместимостью 20 - 25 мл с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл гексана. Колбочку закрывают пришлифованной пробкой и ее стенки тщательно обмывают растворителем.

2.5.2.2.2. Очистка экстракта микросублимацией в вакууме.

Сухой остаток с помощью 2 - 3 мл хлороформа количественно переносится в патрон сублиматора. Патрон помещают на горячую баню и полностью удаляют растворитель, регулируя равномерное распределение остатка по дну сублиматора. В патрон помещают "палец" сублиматора и проводят микросублимацию Цимоксанила на кипящей бане при 0,1 - 0,3 мм рт. ст. в течение 40 мин. После окончания сублимации Цимоксанил смывают с "пальца" сублиматора в грушевидную колбочку вместимостью 25 мл с помощью 10 мл ацетона. Из колбочки с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл гексана. Колбочку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно обмывают растворителем.

2.5.3. Виноград, огурцы, клубни картофеля, зеленая масса. ГЖХ.

Навеску 50 г измельченных плодов огурцов, клубней картофеля, ягод винограда или зеленой массы помещают в коническую колбу объемом 250 мл, добавляют 50 мл этилацетата и встряхивают на приборе для встряхивания 1 час. Затем раствор методом декантации переносят в делительную воронку через фильтр "красная лента". После разделения слоев нижнюю водную фракцию помещают в колбу для повторной экстракции, верхний слой этилацетата собирают в концентратор.

Повторно проводят экстракцию 50 мл этилацетата в течение 0,5 часа. Органический экстракт объединяют, добавляют в концентратор 20 мл дистиллированной воды и отгоняют этилацетат на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 50 °C.

2.5.3.1. Очистка экстракта. Водный экстракт помещают в делительную воронку, ополаскивая концентратор 30 мл воды. Добавляют в воронку 20 мл хлороформа и интенсивно встряхивают 2 минуты. После разделения фаз нижний хлороформный слой собирают в стакан объемом 100 мл. Экстракцию повторяют дважды, используя по 20 мл хлороформа, объединенный хлороформный экстракт помещают в чистую делительную воронку, добавляют туда 10 мл 0,1 н соляной кислоты и интенсивно встряхивают 2 минуты. После разделения фаз нижний хлороформовый слой собирают в конический концентратор, пропуская его через слой безводного серно-кислого натрия. Осушитель ополаскивают 10 мл хлороформа. Экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 50 °C. Последние капли растворителя удаляют током воздуха. Сухой остаток растворяют в 1 мл этилацетата и вводят в хроматограф 2,5 мкл пробы.

2.5.4. Клубни картофеля. ТСХ.

Навеску анализируемой пробы (50 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 500 мл, заливают 100 мл этилацетата и проводят экстракцию Цимоксанила при помощи механического встряхивания колбы в течение 30 мин. Экстракт фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 500 мл. Экстракцию Цимоксанила повторяют еще дважды тем же количеством растворителя. Этилацетат удаляют с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью. Далее очистку экстракта можно проводить двумя способами: хроматографией на колонке с оксидом алюминия или микросублимацией в вакууме (п. п. 2.5.2.2.1 и 2.5.2.2.2).

2.6.1. Условия хроматографирования.

2.6.1.1. ГЖХ.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 2,5 - 37,5 нг. Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю высоту пика. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 15 мкг/мл, разбавляют.

2.6.2.2. ТСХ.

На хроматографические пластинки Сорбифил с помощью микрошприца на 100 мкл или микропипетки на 0,1 мл наносят аликвотную часть полученного по пунктам (2.5.1, 2.5.2.2.1, 2.5.2.2.2) раствора (100 мкл). Справа и слева таким же способом наносят серию стандартных растворов Цимоксанила с содержанием 0,2; 0,3; 0,4; 0,5...1,0 мкг. Градуировочные растворы готовят в градуированных пробирках вместимостью 10 мл с пробками на шлифе согласно табл. 3.

2.6.2. Обработка результатов анализов

2.6.2.1. ГЖХ.

2.6.2.2. ТСХ.

Количественное определение Цимоксанила проводят путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартов.

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

ГЖХ. Калинин В.А., профессор, к. с-х. н.; Калинина Т.С., к. с-х. н.; Довгилевич А.В., к. хим. н.; Довгилевич Е.В., к. биол. н.

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева. 127550, Москва, Тимирязевский пр., 2, кафедра химических средств защиты растений. Телефон: (095) 976-02-20.

ТСХ. ВНИИХСЗР, г. Москва, Новикова К.Ф., к. хим. н. и др.