"МУК 4.1.1217-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифлубензурона в воде, почве, пастбищных травах и люцерне методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Минздравом России 16.03.2003)

1. Подготовлены: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. А.В. Довгилевич); при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов). Разработчики методик указаны в конце каждой из них.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 16 марта 2003 г.

4. Введены с 1 июля 2003 г.

5. Введены впервые.

Фирма производитель: Uniroyal Chemical Ltd (Великобритания).

Торговое наименование: Димилин.

Действующее вещество: дифлубензурон.

1 -(4-хлорфенил)-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина (IUPAC).

N - {[(4-хлорфенил)амино]карбонил}-2,6-дифторбензамид (С.А.).

Структурная формула: (не приводится).

Гигиенические нормативы:

ОДК в почве - 0,2 мг/кг;

ПДК в воде водоемов - 0,01 мг/куб. дм.

Область применения препарата. Дифлубензурон используется для уничтожения широкого диапазона насекомых-вредителей, питающихся листьями лесных и плодовых деревьев, а также плодами.

Уничтожает некоторых главных вредителей хлопка, бобов, сои, цитрусовых, чая, овощных культур и грибов. Также позволяет уничтожать личинки летающих насекомых, в т.ч. москитов, кузнечиков и миграционной саранчи. Эффективен против яблоневой плодожорки, американской белой бабочки, листоверток и др.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении дифлубензурона методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью и очистке путем перераспределения между двумя жидкими фазами, а также на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1, 2.

2.1.3. Избирательность метода

Присутствие других пестицидов, близких по химическому строению и области применения, определению не мешает.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы растительных материалов хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °С. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, пробы пастбищных трав и люцерны измельчают на лабораторной мельнице. Пробы воды хранят при температуре не выше 4° С в течение 3 суток, при температуре -18 °С - в течение месяца.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы очищают, сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками. Гексан и хлористый метилен встряхивают с небольшими порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания свежей порции кислоты, затем промывают водой, 2%-ным раствором гидроксида натрия и снова водой, после чего их сушат над гидроксидом натрия и перегоняют.

Диэтиловый эфир (1 л) предварительно встряхивают с 20 мл свежеприготовленного раствора железного купороса (30 г сульфата железа в 55 мл воды с добавлением 1,5 г концентрированной серной кислоты).

Затем диэтиловый эфир последовательно промывают 0,5%-ным раствором перманганата калия, 5%-ным раствором гидроксида натрия и водой, после чего сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

Ацетонитрил сушат над пентоксидом фосфора и перегоняют; отогнанный растворитель повторно перегоняют над углекислым калием.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку Symmetry-C18 кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 ч.

2.5.3. Приготовление растворов

2.5.4. Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Берут точную навеску дифлубензурона (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/мл). Градуировочные растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/мл готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил - бидистиллированная вода, 56:44, по объему). Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

2.5.5. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация дифлубензурона в растворе) в хроматограф вводят по 20 мкл градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации дифлубензурона в градуировочном растворе (мкг/мл).

2.5.6. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл смеси гексан - диэтиловый эфир (80:20, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой флорисила высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 50 мл смеси гексан - диэтиловый эфир (55:45, по объему) и 30 мл смеси гексан - диэтиловый эфир (80:20, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.7. Проверка хроматографического поведения дифлубензурона на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 мл отбирают 0,1 мл стандартного раствора дифлубензурона с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха, остаток растворяют в 5 мл элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 мл элюента N 1 и также наносят на колонку. Промывают колонку 50 мл элюента N 1, затем 40 мл элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 мл каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание дифлубензурона по п. 2.6.5.

Фракции, содержащие дифлубензурон, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.5. Рассчитывают содержание дифлубензурона в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Примечание: Профиль вымывания дифлубензурона может меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.8. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6.1. Определение дифлубензурона в воде

К образцу предварительно отфильтрованной воды объемом 100 мл добавляют 10 г NaCl и перемешивают до растворения соли. Полученный раствор переносят в делительную воронку емкостью 250 мл и экстрагируют дифлубензурон гексаном трижды порциями по 30 мл, встряхивая каждый раз в течение 2 - 3 мин. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл гексана. После этого экстракт упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С.

Сухой остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Определение дифлубензурона в почве

Образец воздушно-сухой почвы массой 10 г помещают в коническую колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой, добавляют 40 мл 50%-ного водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды с 30 мл 50%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (50 - 55 мл) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С.

Водный остаток переносят в делительную воронку объемом 250 мл, добавляют 50 мл 20%-ного раствора NaCl и дифлубензурон экстрагируют гексаном трижды по 30 мл, встряхивая делительную воронку каждый раз по 2 - 3 мин. Объединенный экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл гексана. Полученный раствор упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Определение дифлубензурона в пастбищных травах и люцерне

Навеску массой 10 г измельченных на ножевой мельнице пастбищных трав или люцерны помещают в коническую колбу емкостью 100 мл и экстрагируют дифлубензурон 40 мл водного ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды порциями по 30 мл. Объединенный экстракт концентрируют на роторном испарителе при температуре 40 °С до объема 50 - 55 мл.

Дифлубензурон переэкстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 мл, встряхивая делительную воронку в течение 2 - 3 мин. Верхний водный слой отбрасывают. Объединенный экстракт промывают в делительной воронке трижды 0,1 М раствором бикарбоната натрия порциями по 30 мл и один раз 50 мл 0,02 М раствора ортофосфорной кислоты, встряхивая воронку в течение 2 - 3 мин. (при всех промывках верхний водный слой отбрасывают). Органическую фазу фильтруют через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 мл хлористого метилена. Полученный раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

Примечание. Для высушенных растительных проб целесообразно проводить экстракцию дифлубензурона тремя порциями дихлорметана по 30 мл каждая на ультразвуковой бане (продолжительность каждой экстракции - 15 мин.), минуя стадию переэкстракции из водного раствора.

2.6.4. Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. п. 2.6.2 и 2.6.3 экстрактов растительного материала или почвы, количественно переносят тремя 3-миллилитровыми порциями смеси гексан - диэтиловый эфир (80:20, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 50 мл элюента N 1, который отбрасывают. Дифлубензурон элюируют 40 мл элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 50 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 мкл раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки, или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка Symmetry-С18 (250 х 4,6 мм), зернение 5 мкм (Waters, USA), или аналогичная.

Температура колонки 30 °С.

Предколонка Waters Symmetry-C18 для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 56:44 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 260 нм.

Объем вводимой пробы 20 мкл. Время удерживания дифлубензурона (11,6 +/- 0,1) мин.

Линейный диапазон детектирования 0,05 - 2,00 мкг/мл.

2.6.6. Обработка результатов анализа

Содержание остаточных количеств дифлубензурона в анализируемом образце вычисляют как среднее из 3-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дифлубензурона 2 мкг/мл, разбавляют.

При проведении работы необходимо соблюдать требования инструкции "Основные правила безопасной работы в химической лаборатории", общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, а также инструкции по эксплуатации жидкостного хроматографа и электрооборудования до 400 В.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95 "ГСИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа".

Юзихин О.С, Черменская Т.Д., Цибульская И.А., Долженко В.И. Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений. 196608, Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3. Телефон: 470-41-98.