"МУК 4.1.772-99. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Газохроматографическое определение концентраций метилового, этилового, изопропилового, пропилового, изобутилового и бутилового спиртов в крови. Методические указания"
(утв. Минздравом России 06.07.1999)

1. Разработаны под редакцией академика РАЕН, д.м.н., проф. Зайцевой Н.В., к.б.н. Улановой Т.С, к.б.н. Нурисламовой Т.В., Карнажицкой Т.Д., Суетиной Г.Н., Поповой Н.В., Митрофановой В.М., Плаховой Л.В., Рудаковой Е.А. (ПНИКИ детской экопатологии).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 6 июля 1999 г.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 8.563-96 "Методики выполнения измерений", ГОСТа Р 1.5-92 "Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа метрологически аттестована и обеспечивает определение метилового, этилового, изопропилового, пропилового, изобутилового и бутилового спиртов в моче в следующих диапазонах:

Методика обеспечивает выполнение измерений с суммарной погрешностью результата измерений при доверительной вероятности 0,95:

Методика основана на предварительном выделении спиртов из биологического материала путем нагревания объекта в герметичном объеме и последующего газохроматографического анализа равновесной паровой фазы над жидкой пробой.

Измерение концентрации метилового, этилового, пропилового, изопропилового, бутилового и изобутилового спиртов выполняют методом газовой хроматографии с пламенно-ионизационным детектированием.

Нижний предел измерения в объеме пробы:

Определению не мешают ароматические углеводороды, спирты, альдегиды, карбоновые кислоты и другие органические соединения. Длительность анализа, включая подготовку пробы, - 40 мин.

При выполнении анализа применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы.

Помещение для проведения измерений должно соответствовать требованиям "Пожарных норм проектирования зданий и сооружений" (СНиП ПА-5-700) и "Санитарных норм проектирования промышленных предприятий" (СН 245-71) и СНиП-74.

При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.007-76.

При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях", утверждены МЗ СССР 20.12.82 (М., 1981), и "Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением", утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87 (М.: Недра, 1989).

При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88.

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

К выполнению хроматографических измерений биологических проб допускаются лица, прошедшие обучение работе на жидкостном хроматографе.

При подготовке проб к анализу и приготовлении растворов соблюдают следующие условия:

- температура воздуха (20 +/- 10) °С;

- атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка хроматографической колонки, приготовление стандартных смесей, установление градуировочной характеристики.

Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном, гексаном, высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелия) с расходом 30 куб. см/мин. при температуре 150 °С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

Исходный стандартный раствор для градуировки. В колбу вместимостью 1000 куб. см вводят микрошприцем по 10 куб. мм метилового, этилового, пропилового, изопропилового, бутилового и изобутилового спиртов и доводят водой до метки. Содержание спиртов в исходной стандартной смеси составляет (с учетом плотности и содержания основного вещества):

Срок хранения исходного стандартного раствора в холодном месте - не более 2 суток.

Градуировочную характеристику устанавливают методом абсолютной градуировки на градуировочных смесях спиртов. Она выражает зависимость площади пика на хроматограмме (кв. мм) от концентрации соответствующего спирта в крови (мкг/куб. см) и строится по 5 сериям стандартных растворов для градуировки. Каждую серию, состоящую из 5 рабочих стандартных растворов, готовят в герметично закрывающихся стеклянных сосудах (прилож. Б - не приводится). Для этого в каждый сосуд вносят 2 куб. см цельной крови, не содержащей спирты, и добавляют исходный раствор в соответствии с таблицей. Срок хранения растворов - 8 ч.

Сосуд закрывают навинчивающейся крышкой с инертной прокладкой и нагревают на водяной бане при температуре 95 - 96 °С в течение 10 мин. 5 куб. см равновесной паровой фазы вводят в колонку хроматографа и анализируют при следующем режиме работы прибора:

На полученной хроматограмме определяют площади пиков соответствующих спиртов и по средним результатам из 5 серий строят градуировочную характеристику. Градуировку проверяют 1 раз в неделю и при смене партии реактивов.

Для отбора проб используют чистую посуду с плотно закрывающейся крышкой. Отобранную для анализа пробу венозной крови в количестве 2 куб. см сразу анализируют или хранят в холодильнике не более 24 ч при температуре не выше 4 °С.

2 куб. см анализируемой крови переносят в сосуд, закрывают его инертной прокладкой и навинчивающейся крышкой с отверстием в центре и нагревают на водяной бане при температуре 95 - 96 °С в течение 10 мин. Затем отбирают подогретым стеклянным шприцем 5 куб. см равновесной паровой фазы и вводят в колонку хроматографа при вышеуказанном режиме работы прибора.

Рассчитывают площадь пика соответствующего спирта по формуле:

где:

h - высота пика, мм;

L - ширина пика на половине высоты, мм.

По градуировочному графику определяют концентрацию соответствующего спирта в крови (мкг/куб. см).

Внутренний оперативный контроль качества результатов контрольного химического анализа (сходимость, воспроизводимость, точность) осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве анализов и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению (МИ 2335-95).

Контролируемым параметром является относительный размах выходных сигналов хроматографа при вводах трех параллельных проб градуировочного раствора. Контроль осуществляется при проведении градуировки, при периодическом контроле градуировочных коэффициентов, а также при выполнении измерений.

Результат контроля признается положительным при выполнении условия:

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются представительные пробы биосред, к которым делаются добавки в виде раствора. Отбирают 2 пробы и к одной из них делают добавку в виде раствора таким образом, чтобы их содержание увеличилось по сравнению с исходным на 50 - 150%. Каждую пробу анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы Х и рабочей пробы с добавкой Х'. Результаты анализа исходной рабочей пробы Х и рабочей пробы с добавкой Х' получают не по возможности, а в одинаковых условиях, т.е. их получает один аналитик с использованием одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и их устраняют.