"МУК 4.1.3696-21. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой концентрации фитазы в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.06.2021)

1. Разработаны ФГБОУ ВО "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Минздрава России (Н.И. Шеина), ООО "Алгама" НИЦ "Экос" (Н.П. Сергеюк).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 2 июня 2021 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации фитазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,5 - 10,0 мг/м³.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Роспотребнадзора, а также могут быть использованы в лабораториях промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, научными и другими организациями, осуществляющими исследования за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Фитазы (мио-инозитол-1,2,3,4,5,6-гексакисфосфат-фосфогидролазы) - группа ферментов, относящихся к классу гидролаз и подклассу фосфатаз, осуществляющих высвобождение хотя бы одного фосфат-иона из молекулы фитиновой кислоты. В результате гидролиза фитиновой кислоты образуются низшие, т.е. содержащие менее шести остатков фосфорной кислоты, инозитолфосфаты, инозитол и неорганический фосфат, а также высвобождаются связанные с фитатами катионы.

В соответствии с Международной номенклатурой ферментов IUPAC-IUBMB различают три типа фитаз: 3-фитазы, 5-фитазы и 4/6-фитазы. Фитазы различных типов начинают трансформацию фитиновой кислоты с гидролиза эфирной связи при различных атомах углерода инозитольного кольца, в результате чего образуются различные изомеры низших инозитолфосфатов.

2.2. Физико-химические свойства фитазы. Фитаза активностью 50 000 ед/г получена путем глубинного культивирования штамма-продуцента дрожжевого гриба Komagataella (Pichia) pastoris ВКПМ Y-4225. Фитаза - мелкокристаллический порошок желтовато-зеленоватого цвета со слабым запахом, хорошо растворим в воде. Содержание фермента - не менее 98% в пересчете на сухое вещество. Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

2.3. Токсикологическая характеристика фитазы:

- является активной субстанцией препарата "Фитаза", для получения которого фермент смешивается с пшеничной мукой в соотношении 1 : 2;

- препарат "Фитаза" является малотоксичным веществом при введении в желудок (4-й класс опасности по ГОСТ 12.1.007), обладает слабым раздражающим действием на слизистые оболочки глаз, слабо кумулирует в организме, обладает общетоксическим действием.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой при выполнении измерений массовой концентрации фитазы метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1, (при доверительной вероятности P = 0,95).

4.1. Измерение массовой концентрации фитазы выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым детектированием. Метод основан на разделении фитазы и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом, с последующей регистрацией фитазы с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации фитазы.

Измерение проводят при длине волны 195 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.

Минимально определяемое содержание фитазы в анализируемом объеме раствора пробы - 0,01 мкг.

Нижний предел измерений массовой концентрации фитазы в воздухе 0,5 мг/м³ (при отборе 20 дм³ воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе фитазы. Измерению не мешают вспомогательные вещества (пшеничная мука).

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается применение оборудования, вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007, ГОСТ 12.1.005.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.0.004. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов <1>.

--------------------------------

<1> СанПиН 1.2.3685-21 "Гигиенические нормативы и требования к обеспечению безопасности и (или) безвредности для человека факторов среды обитания".

7.1. Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

8.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1. Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, контроль стабильности градуировочной характеристики, отбор проб воздуха.

9.2. Приготовление основного раствора фитазы: основной раствор фитазы с массовой концентрацией 500 мкг/см³ готовят растворением (0,05 +/- 0,0002) г фитазы в воде (осч) в мерной колбе вместимостью 100 см³. Срок хранения раствора - не более 3 суток в холодильнике при температуре плюс 4 °C.

9.3. Приготовление рабочего раствора фитазы N 1: рабочий раствор фитазы с массовой концентрацией 200 мкг/см³ готовят разбавлением 20,0 см³ основного раствора фитазы в мерной колбе вместимостью 50 см³ водой (осч).

Срок хранения раствора - не более суток в холодильнике при температуре плюс 4 °C.

9.4. Приготовление подвижной фазы: в мерную колбу вместимостью 1000 см³ вносят 150 см³ ацетонитрила, 1,2 см³ ортофосфорной кислоты (хч) и доводят объем в колбе до метки водой (осч).

Срок хранения раствора в герметичной стеклянной посуде - не более месяца в холодильнике при температуре плюс 4 °C.

9.5. Подготовку хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

9.6. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания фитазы в анализируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений по пяти концентрациям вещества в каждой серии и контрольного раствора N 0 согласно табл. 2.

На аналитические аэрозольные фильтры, помещенные в бюксы, пипеткой вместимостью 1 см³ наносят рабочий раствор фитазы с массовой концентрацией 200 мкг/см³ в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре и с помощью пипетки вместимостью 5 см³ приливают по 5 см³ воды особо чистой и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры тщательно отжимают, растворы сливают в мерные пробирки вместимостью 10 см³. Фильтры повторно обрабатывают 5,0 см³ воды особо чистой и оставляют на 15 минут периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтры тщательно отжимают и удаляют. Растворы сливают в те же пробирки и доводят объем раствора до 10,0 см³ водой особо чистой. Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы. Аналогично обрабатывается чистый аналитический аэрозольный фильтр (контрольный раствор N 0 (табл. 2)).

Инжектируют в хроматограф по 0,01 см³ каждого из градуировочных растворов (табл. 2) с помощью микрошприца.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания фитазы в анализируемом объеме градуировочных растворов (мкг).

9.7. Условия хроматографирования градуировочных смесей и анализируемых проб:

9.8. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа (после ремонта и поверки прибора).

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 9.6 (соответствующих началу, середине и концу диапазона измерений) и анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

S_изм, S_гр - значение площади пика (приборные единицы) фитазы в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

К_гр - норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное хроматографирование этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика нестабильна (условие (1) не выполняется для двух или более образцов градуировочных растворов), выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов (табл. 2) для установления градуировочной характеристики, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики ее устанавливают заново.

9.7. Отбор проб проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005 и приложения 9 к Р 2.2.2006-05 "Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда".

Одновременно отбирают две пробы. При отборе проб фиксируется температура воздуха и атмосферное давление.

Воздух с объемным расходом 2 дм³/мин аспирируют через аналитический аэрозольный фильтр, помещенный в фильтродержатель. Для определения массовой концентрации фитазы на уровне 0,5 мг/м³ (1/2 ОБУВ) необходимо отобрать не менее 20 дм³ воздуха в течение 10 минут. Отобранные пробы можно хранить в бюксах в течение 3 суток в холодильнике при температуре плюс 4 °C.

10.1. Аналитический аэрозольный фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, приливают 5,0 см³ воды (осч) и оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную пробирку вместимостью 10 см³. Фильтр повторно обрабатывают 5,0 см³ воды особо чистой, оставляют на 15 минут, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Раствор сливают в ту же пробирку, объем раствора доводят до 10 см³ водой особо чистой. Далее раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографическую виалу.

Хроматографический анализ проб выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Установление содержания фитазы (в мкг) в анализируемом объеме пробы проводят по градуировочной характеристике (п. 9.6).

Примечание. Фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в воде вспомогательных веществ, входящих в состав препаративных форм фитазы.

11.1. Массовую концентрацию фитазы в воздухе рабочей зоны C, мг/м³, вычисляют по формуле:

а - содержание фитазы в анализируемом объеме раствора пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

B - общий объем раствора пробы, см³;

б - анализируемый объем раствора пробы, см³;

V₂₀ - объем воздуха, отобранный для анализа, приведенный к условиям в соответствии с ГОСТ 8.395 при температуре 293 °К (20 °C) и атмосферном давлении 101,3 кПа (760 мм рт. ст.), дм³.

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

C₁, C₂ - результаты параллельных определений массовой концентрации фитазы в воздухе рабочей зоны, мг/м³;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики измерений.

12.1. Результат количественного химического анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/м³;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "Массовая концентрация фитазы менее 0,5 мг/м³ (более 10 мг/м³)".

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сравнительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD_0,95 по формуле:

C_ср1, C_ср2 - средние значения массовой концентрации фитазы, полученные в первой и второй лабораториях, мг/м³;

CD_0,95 - значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в п. 5.3.3 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

При разногласиях руководствуются п. 5.3.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

13.2. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.