"МУК 4.1.3876-23. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой концентрации бенз(а)пирена и его метаболитов в экскретах (моче и кале) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 26.06.2023)

1. Разработаны Федеральным бюджетным учреждением науки "Екатеринбургский медицинский научный центр профилактики и охраны здоровья рабочих промпредприятий" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (В.Б. Гурвич, Э.Г. Плотко, Т.Н. Штин, Т.А. Береснева).

2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 26 июня 2023 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим и диодноматричным детекторами для определения массовой концентрации бенз(а)пирена и его метаболитов в экскретах (моче и кале) в диапазонах измерений:

- в моче

1) с флуориметрическим детектором:

- бенз(а)пирен: от 0,12 до 12,00 мкг/100 см³;

- 3-гидроксибенз(а)пирен: от 0,15 до 15,00 мкг/100 см³;

- бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиол: от 0,15 до 15,00 мкг/100 см³;

2) с диодноматричным детектором:

- бенз(а)пирен: от 11,50 до 1200,0 мкг/100 см³;

- 3-гидроксибенз(а)пирен: от 15,00 до 15 000,0 мкг/100 см³;

- бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиол: от 15,00 до 15 000,0 мкг/100 см³;

- в кале

1) с флуориметрическим детектором:

- бенз(а)пирен: от 0,70 до 70,00 мкг/100 г;

- 3-гидроксибенз(а)пирен: от 1,00 до 100,00 мкг/100 г;

- бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиол: от 1,00 до 100,00 мкг/100 г;

2) с диодноматричным детектором:

- бенз(а)пирен: от 70,00 до 7000,0 мкг/100 г;

- 3-гидроксибенз(а)пирен: от 100,00 до 10 000,0 мкг/100 г;

- бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиол: от 100,00 до 10 000,0 мкг/100 г.

1.2. Метод основан на разрушении стенок клеток экскретов щелочным гидролизом анализируемых проб, жидкость-жидкостной экстракции бенз(а)пирена и его метаболитов из обработанных проб экскретов хлористым метиленом, концентрировании экстрактов по технологии упаривания в вихревом потоке газа и анализе экстракта на жидкостном хроматографе с использованием флуориметрического и диодноматричного детекторов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Метод измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностями, не превышающими значений, приведенных в таблицах 1 и 2.

3.1. При выполнении измерений применяют средства измерений, стандартные образцы, вспомогательные устройства, реактивы, материалы (таблица 3).

--------------------------------

<1> 10 мкл = 10 мм³ = 0,01 см³.

4.1. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004, а также соблюдаться требования по электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019.

4.2. Общие санитарно-гигиенические положения к воздуху рабочей зоны определены в ГОСТ 12.1.005.

4.3. К выполнению измерений допускаются специалисты, имеющие высшие или средне-специальное образование, прошедшие специальную подготовку по выполнению химических и аналитических работ, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод в процессе стажировки.

5.1. При выполнении измерений в лаборатории соблюдаются следующие условия:

- температура окружающего воздуха, °C плюс (20 +/- 5);

- атмосферное давление, кПа (мм рт. ст.) 84,0 - 106,7 (630 - 800);

- относительная влажность воздуха, %, не более 80.

5.2. Электропитание при выполнении измерений в лаборатории и проведении отбора проб:

- напряжения питания, В (220 +/- 22);

- частота, Гц (50 +/- 1).

6.1. Чистота воды. При выполнении измерений используют воду для лабораторного анализа 1 степени чистоты по ГОСТ Р 52501.

6.2. Подготовка посуды.

Мойку и сушку посуды следует проводить в помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией.

Всю используемую для хранения и измерений проб посуду промывают азотной кислотой, разбавленной водой для лабораторного анализа 1 степени чистоты в соотношении 1:1 (п. 6.3.1), затем большим количеством водопроводной воды и в заключении ополаскивают три-четыре раза водой для лабораторного анализа 1 степени чистоты, с последующей последовательной промывкой органическими растворителями: этилацетатом (однократно), ацетоном (дважды).

Процедуру промывки органическими растворителями следует проводить в вытяжном шкафу. Рекомендуется на стадиях промывки использовать ультразвуковую ванну. Окончательную сушку посуды проводят в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу, при температуре от плюс 105 °C до плюс 110 °C.

6.3. Приготовление растворов реактивов.

6.3.1. Раствор азотной кислоты с объемной долей 1:1.

Раствор азотной кислоты готовят разбавлением концентрированной кислоты. Для приготовления 1000 см³ раствора берут 500 см³ концентрированной азотной кислоты (удельный вес 1,51 г/см³), отмеренной цилиндром. Отмеренный объем кислоты осторожно при перемешивании вливают в 500 см³ воды для лабораторного анализа 1 степени чистоты в термостойком стакане вместимостью 1000 см³ при охлаждении. Тщательно перемешивают.

Раствор хранят до изменения внешнего вида (изменение цвета, включая мутность, образование хлопьев, осадка).

6.3.2. Изотонический раствор Рингера.

Помещают 7,5 г хлорида натрия, 0,37 г хлорида калия, 0,17 г хлорида кальция в мерную колбу вместимостью 1000 см³, растворяют примерно в 400 см³ воды для лабораторного анализа 1 степени чистоты. После растворения солей доводят до 1000 см³ водой для лабораторного анализа 1 степени чистоты.

Раствор хранят при комнатной температуре 1 месяц.

6.3.3. Спиртовой раствор гидроксида калия, 0,73 моль/дм³.

В стакан вместимостью 100 см³ помещают 8,20 г гидроксида калия, растворяют примерно в 30 см³ воды для лабораторного анализа 1 степени чистоты при нагревании на электроплитке. Раствор охлаждают до комнатной температуры и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 см³. Объем доводят до метки этиловым спиртом.

Раствор хранят до изменения внешнего вида в пластиковой посуде.

6.3.4. Элюент для хроматографии (водный раствор ацетонитрила с объемной долей 4:1).

Для приготовления 1000 см³ раствора берут 800 см³ ацетонитрила, отмеренного цилиндром. Отмеренный объем ацетонитрила при перемешивании вливают в 200 см³ воды для лабораторного анализа 1 степени чистоты в стакане вместимостью 1000 см³ при охлаждении. Тщательно перемешивают.

Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

6.3.5. Основной градуировочный раствор бенз(а)пирена с массовой концентрацией 100 мкг/см³ (раствор N 1).

Для приготовления градуировочного раствора на аналитических весах взвешивают 10,0 мг <2> чистого вещества и переносят количественно н-гексаном в мерную колбу вместимостью 100 см³. Доводят полученный раствор н-гексаном до метки.

--------------------------------

<2> Масса навески для чистого вещества бенз(а)пирена с содержанием основного вещества 98% составляет 10,2 мг соответственно.

Концентрация бенз(а)пирена в полученном градуировочном растворе N 1 - (100,0 +/- 2,3) мкг/см³.

Раствор хранят в посуде из стекла в течение 3 месяцев при температуре от плюс 2 °C до плюс 10 °C.

6.3.6. Рабочий градуировочный раствор бенз(а)пирена с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (раствор N 2).

6.3.6.1. Рабочий градуировочный раствор (N 2) готовят из соответствующего ГСО раствора бенз(а)пирена в соответствии с рекомендацией в инструкции по применению.

Вскрывают ампулу ГСО, содержащего 100 мкг/см³ бенз(а)пирена. Осторожно пипеткой переносят 5,00 см³ ГСО в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят до метки н-гексаном и перемешивают.

Полученный рабочий градуировочный раствор N 2 содержит (10,0 +/- 0,2) мкг/см³ бенз(а)пирена.

Раствор хранят в посуде из стекла в течение 2 месяцев при температуре от плюс 2 °C до плюс 10 °C.

6.3.6.2. Рабочий градуировочный раствор (N 2) готовят соответствующим разбавлением основного градуировочного раствора (N 1).

5,00 см³ раствора N 1 с помощью пипетки переносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, доводят до метки н-гексаном и перемешивают.

Полученный рабочий градуировочный раствор N 2 содержит (10,0 +/- 0,2) мкг/см³ бенз(а)пирена.

Раствор хранят в посуде из стекла в течение 2 месяцев при температуре от плюс 2 °C до плюс 10 °C.

6.3.7. Основной градуировочный раствор 3-гидроксибенз(а)пирена с массовой концентрацией 100 мкг/см³ (раствор N 3).

Для приготовления градуировочного раствора на аналитических весах взвешивают 10,0 мг <3> чистого вещества и переносят количественно метанолом или диметилсульфоксидом (далее - ДМСО) в мерную колбу вместимостью 100 см³. Доводят полученный раствор метанолом или ДМСО до метки.

--------------------------------

<3> Масса навески для чистого вещества 3-гидроксибенз(а)пирена с содержанием основного вещества 95% составляет 10,5 мг соответственно.

Концентрация 3-гидроксибенз(а)пирена в полученном градуировочном растворе N 3 - (100,0 +/- 5,3) мкг/см³.

Приготовленный раствор хранят в морозильнике при температуре не выше минус 20 °C в течение 3 месяцев. Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.8. Рабочий градуировочный раствор 3-гидроксибенз(а)пирена с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (раствор N 4).

1,00 см³ раствора N 3 с помощью пипетки переносят в стаканчики для взвешивания и упаривают в вихревом потоке газа при комнатной температуре.

Содержимое стаканчика для взвешивания количественно н-гексаном переносят в мерную колбу вместимостью 10 см³, доводят до метки н-гексаном и перемешивают. Концентрация 3-гидроксибенз(а)пирена в полученном градуировочном растворе N 4 - (10,0 +/- 0,6) мкг/см³. Приготовленный раствор хранят в морозильнике при температуре не выше минус 20 °C в течение 2 месяцев. Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.9. Основной градуировочный раствор бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола с массовой концентрацией 100 мкг/см³ (раствор N 5).

Для приготовления градуировочного раствора на аналитических весах взвешивают 10,0 мг <4> чистого вещества и переносят количественно метанолом или ДМСО в мерную колбу вместимостью 100 см³. Доводят полученный раствор метанолом или ДМСО до метки.

--------------------------------

<4> Масса навески для чистого вещества бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола с содержанием основного вещества 98% составляет 10,2 мг соответственно.

Концентрация бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола в полученном градуировочном растворе N 5 - (100,0 +/- 2,3) мкг/см³.

Приготовленный раствор хранят в морозильнике при температуре не выше минус 20 °C в течение 3 месяцев. Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.3.10. Рабочий градуировочный раствор бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола с массовой концентрацией 10 мкг/см³ (раствор N 6).

1,00 см³ раствора N 5 с помощью пипетки переносят в стаканчики для взвешивания и упаривают в вихревом потоке газа на воздухе при комнатной температуре.

Содержимое стаканчика для взвешивания количественно н-гексаном переносят мерную колбу вместимостью 10 см³, доводят до метки н-гексаном и перемешивают. Концентрация бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола в полученном градуировочном растворе N 6 - (10,0 +/- 0,3) мкг/см³.

Приготовленный раствор хранят в морозильнике при температуре не выше минус 20 °C в течение 2 месяцев. Перед применением раствор выдерживают при комнатной температуре в темном месте не менее 30 мин.

6.4. Подготовка хроматографической колонки к работе.

Колонку устанавливают в хроматограф и подают элюент со скоростью 1,5 см³/мин до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора.

Подготовку хроматографической колонки к работе проводят в соответствии с рекомендациями руководства по эксплуатации ВЭЖХ. Скорость подачи элюента (в данном случае) установлена производителем прибора.

6.5. Установление градуировочных зависимостей.

Градуировочные растворы бенз(а)пирена и его метаболитов, используемые для построения градуировочной характеристики, готовят в соответствии с таблицами 4 - 5.

--------------------------------

<5> Во избежание нарушения равновесия жидкость - жидкость (плотность метанола: , плотность гексана: , плотность ДМСО: ) 10,00 см³ основного градуировочного раствора N 3 (N 5) с помощью пипетки переносят в стаканчик для взвешивания и упаривают в вихревом потоке газа при комнатной температуре. Содержимое стаканчика для взвешивания количественно н-гексаном переносят в мерную колбу вместимостью 10,00 см³, доводят до метки н-гексаном и перемешивают.

Растворы для градуировки готовят в мерных колбах вместимостью 10,00 см³.

После добавления каждого реактива содержимое колб тщательно перемешивают.

Объем раствора в каждой колбе доводят до метки гексаном и тщательно перемешивают.

Растворы готовят в день использования.

Градуировочные характеристики строят при помощи "матричной" градуировки. Для этого проводят обработку "чистых" проб ("чистые" пробы выбирают среди проб того же вида биосубстратов - экскреты (моча, кал), проанализированных тем же методом ранее, и не содержащих бенз(а)пирена и его метаболитов) в соответствии с главами VIII, IX. На стадии перерастворения перед введением в хроматограф в стаканчики для взвешивания с обработанной пробой экскретов добавляют по 1 см³ градуировочных растворов бенз(а)пирена и его метаболитов (таблицы 3 - 4), тщательно перемешивают. Полученные растворы фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не более 0,45 мкм, используя медицинский шприц "Луер", в стеклянную виалу вместимостью 2 см³ и анализируют на жидкостном хроматографе в условиях:

- инжектируемый объем 5 мм³;

- колонка хроматографическая обращенно-фазная, заполненная силикагелем с привитым октадицилом длиной 150 мм с диаметром частиц сорбента не более 5 мкм;

- режим подачи элюента (80% ацетонитрила и 20% воды) - изократический;

- скорость подачи элюента 1,0 см³/мин;

Инструментальные параметры и программа хроматографирования подобрана экспериментально. Скорость подачи элюента при построении градуировочной зависимости и проведении исследований с использованием рабочих проб составляет 1,0 см³/мин.

- температура термостата колонки 40 °C;

- флуориметрический детектор (таблица 3):

а) для бенз(а)пирена

- длина волны возбуждения 260 нм;

- длина волны эмиссии 415 нм;

б) для бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола

- длина волны возбуждения 260 нм;

- длина волны эмиссии 415 нм;

в) для 3-гидроксибенз(а)пирена

- длина волны возбуждения 260 нм;

- длина волны эмиссии 445 нм;

- диодноматричный детектор (таблица 4):

а) для бенз(а)пирена, бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола, 3-гидроксибенз(а)пирена

- аналитическая длина волны 254 нм (референсная длина волны 390 нм).

Для установления градуировочных зависимостей выполняют измерения аналитического сигнала холостого опыта (градуировочный раствор N 1), представляющего собой "чистую" пробу, выбранную из проб того же вида биосубстрата - экскреты (моча, кал), проанализированную тем же методом ранее, и не содержащую бенз(а)пирен и его метаболиты в соответствии с главами VIII, IX. Далее выполняют измерения градуировочных образцов различных уровней концентраций в порядке их возрастания в соответствии с таблицами 4, 5.

Затем, используя программное обеспечение для сбора и обработки хроматографических данных, устанавливают градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика на хроматограмме (в единицах оптической плотности для диодноматричного детектора и в единицах флуоресценции для флуориметрического детектора) от массовой концентрации бенз(а)пирена и его метаболитов (мкг/см³).

Построение графиков допускается проводить при помощи программы обработки данных ВЭЖХ или при помощи компьютерной программы (например, электронные таблицы).

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят по п. 12.2.

7.1. Отбор проб экскретов у человека.

Пробы экскретов отбирают в специальные одноразовые контейнеры для анализов по общепринятым правилам взятия экскретов в соответствии с ГОСТ Р 53079.4.

Оптимальный объем пробы мочи на химическое исследование (1 - 10) см³.

Оптимальная масса пробы кала на химическое исследование (0,2 - 2) г.

Допускается хранение проб экскретов в пластиковой посуде с плотно закрывающейся крышкой в холодильной камере при минус 20 °C в течение 1 - 2 лет. В ходе проведения анализа допускается кратковременное хранение (в течение 1 - 3 дней) в холодильнике при минус 4 °C.

7.2. Отбор проб экскретов у животных.

Пробы экскретов отбирают в утренние часы перед кормлением, обычно при самопроизвольном мочеиспускании и испражнении по общепринятым правилам взятия экскретов у животных.

Собирают экскреты в чистые сосуды с широким "горлом".

Когда невозможно получить мочу самопроизвольно, ее берут из мочевого пузыря путем катетеризации.

Для сбора суточной мочи или за 6 - 12 ч у крупных животных используют мочеприемники.

Для сбора экскретов у мелких животных используют специальные метаболические клетки.

Оптимальный объем пробы мочи на химическое исследование (1 - 10) см³.

Оптимальная масса пробы кала на химическое исследование (0,2 - 2) г.

Допускается хранение проб экскретов в пластиковой посуде с плотно закрывающейся крышкой в холодильной камере при минус 20 °C в течение 1 - 2 лет. В ходе проведения анализа допускается кратковременное хранение (в течение 1 - 3 дней) в холодильнике при минус 4 °C.

8.1. Обработка проб мочи.

Пробы гомогенизируют.

(1 - 10) см³ анализируемой мочи в зависимости от ожидаемого содержания определяемых аналитов в пробе из одноразового контейнера для анализов помещают в одноразовый медицинский шприц типа "Луер" вместимостью 50 см³ с надетым на наконечник шприца запорным краном, прибавляют 5 см³ 0,73 моль/дм³ раствора гидроксида калия в этиловом спирте (п. 6.3.3). Раствор тщательно перемешивают, закрывают воронкой и помещают на кипящую водную баню на 40 мин. После окончания процесса щелочного гидролиза медицинский шприц типа "Луер" с анализируемой пробой снимают с водяной бани, охлаждают до комнатной температуры.

Для экстракции бенз(а)пирена и его метаболитов к содержимому медицинского шприца типа "Луер" добавляют 5 см³ хлористого метилена и интенсивно перемешивают в течение 2 мин. После полного разделения слоев органический слой экстракта переносят в стаканчик для взвешивания. Для улучшения разделения слоев к анализируемому образцу допускается добавлять несколько капель этилового спирта. Описанную процедуру экстракции повторяют еще дважды, объем хлористого метилена для второй экстракции - 3 см³, для третьей экстракции - 2 см³. Объединенные экстракты упаривают в вихревом потоке газа на воздухе при комнатной температуре.

8.2. Обработка проб кала.

Перед исследованиями пробы кала замораживают при температуре не выше минус 20 °C для разрушения стенок клеток и извлечения из клеток белков, в которые встраивается бенз(а)пирен и его метаболиты.

После заморозки пробы кала выдерживают при комнатной температуре в темном месте не более 1 часа.

Пробы гомогенизируют.

(0,2 - 2) г анализируемого кала в зависимости от ожидаемого содержания определяемых аналитов в пробе из одноразового контейнера для анализов помещают в одноразовый медицинский шприц типа "Луер" вместимостью 50 см³ с надетым на наконечник шприца запорным краном, прибавляют 5 см³ изотонического раствора Рингера п. 6.3.2 и 5 см³ 0,73 моль/дм³ раствора гидроксида калия в этиловом спирте (п. 6.3.3). Раствор тщательно перемешивают, закрывают воронкой и помещают на кипящую водную баню на 1 час. После окончания процесса щелочного гидролиза медицинский шприц типа "Луер" с анализируемой пробой снимают с водяной бани, охлаждают до комнатной температуры.

Для экстракции бенз(а)пирена и его метаболитов к содержимому медицинского шприца типа "Луер" добавляют 5 см³ хлористого метилена и интенсивно перемешивают в течение 2 мин. После полного разделения слоев органический слой экстракта переносят в стаканчик для взвешивания. Для улучшения разделения слоев к анализируемому образцу допускается добавлять несколько капель этилового спирта. Описанную процедуру экстракции повторяют еще дважды, объем хлористого метилена для второй экстракции - 3 см³, для третьей экстракции - 2 см³. Объединенные экстракты упаривают в вихревом потоке газа при комнатной температуре.

9.1. В стаканчики для взвешивания с обработанной пробой экскретов добавляют 1 см³ н-гексана, тщательно перемешивают. Полученный раствор (концентрат) объемом 1 см³ фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не более 0,45 мкм, используя медицинский шприц типа "Луер" вместимостью 1 см³, в стеклянную виалу вместимостью 2 см³ и хроматографируют на жидкостном хроматографе в условиях, указанных в п. 6.5.

9.2. Идентификацию бенз(а)пирена и его метаболитов проводят путем сравнения абсолютных времен удерживания хроматографических пиков в анализируемой пробе и градуировочных растворах.

10.1. Содержание бенз(а)пирена и его метаболитов, приходящееся на 100 см³ анализируемой пробы мочи (X, мкг/100 см³), рассчитывают по формуле:

где C - массовая концентрация бенз(а)пирена или его метаболитов, найденная по градуировочной зависимости в соответствии с п. 6.5, мкг/см³;

l - объем концентрата, см³;

100 - коэффициент пересчета анализируемой пробы мочи на 100 см³;

V - анализируемый объем пробы мочи, полученный в соответствии с п. 8.1, см³;

К - коэффициент, учитывающий степень экстракции бенз(а)пирена и его метаболитов из мочи:

К = 0,70 - для бенз(а)пирена;

К = 0,50 - для метаболитов (бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола и 3-гидроксибенз(а)пирена).

10.2. Содержание бенз(а)пирена и его метаболитов, приходящееся на 100 г анализируемой пробы кала (X, мкг/100 г), рассчитывают по формуле:

где C - массовая концентрация бенз(а)пирена или его метаболитов, найденная по градуировочной зависимости в соответствии с п. 6.5, мкг/см³;

l - объем концентрата, см³;

100 - коэффициент пересчета анализируемой пробы кала на 100 г;

m - анализируемая масса пробы кала, полученная в соответствии с п. 8.2, г;

К - коэффициент, учитывающий степень экстракции бенз(а)пирена и его метаболитов из кала:

К = 0,70 - для бенз(а)пирена;

К = 0,50 - для метаболитов (бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола и 3 гидроксибенз(а)пирена).

11.1. Результат измерений по настоящей методике в документах, предусматривающих ее использование, представляют в виде:

где X - содержание бенз(а)пирена или его метаболитов в анализируемой пробе, мкг/100 см³;

- значение абсолютной погрешности, мкг/100 см³, рассчитанное по формуле:

где - показатель точности (границы относительной погрешности), приведенный в таблице 1, %.

11.2. Численные значения результатов измерений должны оканчиваться цифрой того же разряда, что и значения характеристики погрешности, которые не должны содержать более двух значащих цифр.

12.1. Общие сведения.

12.1.1. Контроль точности результатов измерений при реализации методики в лаборатории предусматривает:

- контроль стабильности градуировочной характеристики;

- оперативный контроль исполнителем процедуры выполнения измерений на основе оценки погрешности при реализации отдельно взятой контрольной процедуры;

- проверка приемлемости результатов, полученных в условиях внутрилабораторной прецизионности.

12.1.2. Периодичность контроля исполнителем процедуры выполнения измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений проводятся в соответствии с руководством по качеству аккредитованной лаборатории.

12.2. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

12.2.1. Стабильность градуировочной характеристики контролируют не реже, чем через каждые 15 проб.

12.2.2. Для этого дважды проводят измерения аналитического сигнала одного и того же градуировочного раствора, приготовленного по п. 6.5, вычисляют относительное отклонение средней концентрации, найденной по градуировочной характеристике, от номинального значения концентрации градуировочного раствора. Используют не менее двух градуировочных растворов бенз(а)пирена или его метаболитов с массовой концентрацией, близкой к началу и концу градуировочной характеристики.

12.2.3. Градуировочная зависимость признается стабильной, если для обоих градуировочных растворов выполняется условие:

где C - действительное значение массовой концентрации бенз(а)пирена или его метаболитов в градуировочном растворе, мкг/см³;

C_к - результат контрольного измерения массовой концентрации бенз(а)пирена или его метаболитов в этом же градуировочном растворе, мкг/см³;

- относительная погрешность построения градуировочной характеристики:

- для бенз(а)пирена

- для бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола

- для 3-гидроксибенз(а)пирена

- для бенз(а)пирена

- для бенз(а)пирена-транс-7,8-дигидродиола

- для 3-гидроксибенз(а)пирена.

В случае невыполнения условия (4) для выбранных градуировочных растворов с массовой концентрацией, близкой к началу и концу градуировочной характеристики, проводят повторную градуировку прибора. Если условие (5) не выполняется только для одного градуировочного раствора, то этот раствор измеряют повторно. Если при повторном измерении условие (5) выполняется, то градуировочная характеристика считается стабильной, если условие не выполняется, то проводят повторную градуировку прибора.

Градуировочная характеристика в таком случае соответствует линейной зависимости с коэффициентом корреляции не менее 0,95.

12.3. Алгоритм оперативного контроля процедуры выполнения измерений с использованием образца для контроля.

12.3.1. Образец для контроля (далее - ОК) представляет собой матричный раствор для градуировки.

На стадии перерастворения перед введением в хроматограф в стаканчики для взвешивания с обработанной пробой экскретов добавляют 1 см³ градуировочного раствора бенз(а)пирена и его метаболитов, тщательно перемешивают. Полученный раствор фильтруют через мембранный фильтр с размером пор не более 0,45 мкм, используя медицинский шприц "Луер", в стеклянную виалу вместимостью 2 см³ и анализируют на жидкостном хроматографе в условиях, указанных в п. 6.5.

12.3.2. Результат контрольной процедуры К_к, мкг/100 см³, рассчитывают по формуле:

где X - содержание бенз(а)пирена или его метаболитов в ОК, мкг/100 см³;

C - рассчитанное содержание бенз(а)пирена или его метаболитов в ОК, мкг/100 см³.

12.3.3. Норматив контроля погрешности К_n рассчитывают по формуле

где - абсолютное значение характеристики погрешности результата измерений, соответствующее массовой концентрации бенз(а)пирена или его метаболитов в исследуемой пробе, мкг/100 см³:

12.3.4. Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию:

процедуру признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (9) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (9) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

12.4. Алгоритм проведения контрольной процедуры при контроле внутрилабораторной прецизионности.

12.4.1. Контроль внутрилабораторной прецизионности осуществляют для результатов измерений, полученных в соответствии с методикой в условиях внутрилабораторной прецизионности (разные исполнители и (или) разное время, и (или) разные наборы средств измерений и т.д.). В качестве образца для контроля используют рабочие пробы экскретов.

12.4.2. Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

где X₁ и X₂ - результаты контрольных измерений содержания бенз(а)пирена или его метаболитов в образце для контроля, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, мкг/100 см³;

R_л - абсолютное значение допускаемого расхождения между двумя результатами, полученными в одной лаборатории в условиях внутрилабораторной прецизионности, мкг/100 см³, рассчитываемое по формуле:

где X - среднее арифметическое значение контрольных результатов измерений содержания бенз(а)пирена или его метаболитов в образце для контроля, мкг/100 см³;

- относительное значение показателя внутрилабораторной прецизионности (таблица 1), %.

12.4.3. При выполнении условия (10) говорят об удовлетворительной внутрилабораторной прецизионности результатов измерений.

При превышении предела внутрилабораторной прецизионности анализ повторяют. При повторном превышении указанного предела выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

1. Федеральный закон от 30 марта 1999 г. N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты.

3. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия".

4. ГОСТ Р 53079.4 "Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа".

5. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

6. ГОСТ Р ИСО 5725-1 - ГОСТ Р ИСО 5725-6 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

7. ГОСТ 8.315 "Государственная система обеспечения единства измерений. Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов. Основные положения".

8. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

9. ГОСТ 12.1.005 "Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны".

10. ГОСТ 450 "Кальций хлористый технический. Технические условия".

11. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

12. ГОСТ 2222 "Метанол технический. Технические условия".

13. ГОСТ 2768 "Ацетон технический. Технические условия".

14. ГОСТ 4233 "Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия".

15. ГОСТ 4461 "Реактивы. Кислота азотная. Технические условия".

16. ГОСТ 4568 "Калий хлористый. Технические условия".

17. ГОСТ 8981 "Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия".

18. ГОСТ 24363 "Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия".

19. ГОСТ 23932 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия".

20. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

21. ГОСТ 28311 "Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

22. ГОСТ 29169 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой".

23. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования".

24. ГОСТ ISO 7886-1 "Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования (с Поправками)".

25. ТУ 6-09-1710 "Этанол для хроматографии (этиловый спирт) химически чистый. Технические условия".

26. ТУ 6-09-3818 "Диметилсульфоксид (метилсульфоксид). Технические условия".

27. ТУ 2631-001-54260861 "Гексан для хроматографии".

28. ТУ 2634-002-04715285 "Ацетонитрил".

29. СТП ТУ СОМР 3-102 "Дихлорметан для спектроскопии (метилен хлористый)".