"МУК 4.1.3775-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика определения фенолфталеина и фуросемида в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 07.06.2022)

1. Разработаны ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (В.А. Тутельян, К.И. Эллер, И.Б. Перова, А.В. Мусатов, А.С. Кошечкина, В.А. Батурина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 7 июня 2022 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (далее - ВЭЖХ-ДМД) и масс-спектрометрическим детектором (далее - ВЭЖХ-МС) для определения массовых концентраций фенолфталеина и фуросемида в биологически активных добавках (далее - БАД) к пище и специализированной пищевой продукции (далее - СПП) в диапазоне от 2,5 до 100 мг/г.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Рациональное название: фенолфталеин - 4,4'-диоксифталофенон, систематическое название (IUPAC) <1> - 3,3-бис(4-гидроксифенил)-2-бензофуран-1(3H)-он. Химическое название и химическая формула вещества (рис. 1).

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Фенолфталеин представляет собой кристаллический порошок белого цвета. Растворимость: очень хорошо растворим в полярных органических растворителях - метаноле, этаноле, ацетоне (растворимость в этаноле - 100 г/л); хорошо растворим в диэтиловом эфире, хлороформе, толуоле (растворимость в диэтиловом эфире - 10 г/л); ограниченно растворим в воде (растворимость в воде - 0,4 г/л при плюс 25 °C); практически нерастворим в бензоле и петролейном эфире. Молярная масса фенолфталеина составляет 318,33 г/моль. Коэффициент молярной экстинкции в метаноле равен 14692 л·моль^-1·см^-1 .

УФ-спектр фенолфталеина в метаноле характеризуется тремя максимумами поглощения при длинах волн 205 нм, 230 нм и 275 нм.

Фенолфталеин относится к классу трифенилметановых красителей; в химии традиционно применяется в качестве кислотно-основного индикатора. До обнаружения канцерогенных свойств, а также клинических доказательств побочных эффектов на печень, почки и сердечно-сосудистую систему фенолфталеин использовался в медицине как слабительное средство.

Рациональное название: фуросемид, систематическое название (IUPAC) - 5-(аминосульфонил)-4-хлор-2[(2-фуранилметил)] аминобензойная кислота. Химическое название и химическая формула вещества (рис. 2).

Фуросемид представляет собой кристаллический порошок белого цвета. Растворимость: хорошо растворим в метаноле, ацетоне, диметилформамиде, растворах щелочей; ограниченно растворим в хлороформе, диэтиловом эфире, воде (растворимость в воде - 0,0734 г/л при 30 °C). Молярная масса фуросемида составляет 330,74 г/моль.

УФ-спектр фуросемида в 95%-м этаноле характеризуется тремя максимумами поглощения при длинах волн 276 нм, 288 нм и 336 нм. Коэффициенты молярной экстинкции в 95% этаноле равны 31255 л·моль^-1·см^-1 , 19448 л·моль^-1·см^-1 , 4763 л·моль^-1·см^-1 .

Фуросемид является высокоактивным мочегонным средством из группы салуретиков. Фуросемид снижает артериальное давление при гипертонической болезни и усиливает действие гипотензивных средств. Фуросемид применяют при застойных явлениях в малом и большом круге кровообращения, при сердечной недостаточности, портальной гипертензии, поражениях почек. В качестве побочных эффектов фуросемид может вызывать слабость, преходящую гипергликемию и гиперурикемию. Фуросемид приравнен к допинговым препаратам и запрещен к применению у спортсменов Всемирным антидопинговым агентством (ВАДА).

3.1. Методика основана на определении фенолфталеина и фуросемида методом обращенно-фазовой ВЭЖХ-ДМД и подтверждением структуры с помощью ВЭЖХ-МС. Подготовка пробы включает в себя экстракцию метанолом с использованием ультразвуковой бани и последующим центрифугированием и фильтрованием образца. Идентификацию фенолфталеина и фуросемида проводят по совпадению времен удерживания, спектральным данным ВЭЖХ-ДМД и ВЭЖХ-МС. Количественное определение проводится по данным ВЭЖХ-ДМД с использованием метода внешней калибровки.

4.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 2 - 4.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

6.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов.

6.3. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалистов, имеющих высшее или среднее специальное образование, имеющих опыт работы в химико-аналитической лаборатории, владеющих методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

7.1. Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией по отбору проб для определения токсичных элементов для каждого конкретного вида продукции.

8.1. При проведении измерений соблюдаются следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха плюс 15 - 30 °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1. Приготовление растворов хранения стандарта фенолфталеина и фуросемида.

9.1.1. Приготовление раствора хранения стандарта фенолфталеина.

Навеску фенолфталеина (100 +/- 0,2) мг помещают в мерную колбу на 100 см³, добавляют 80 см³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентрацией 1000 мкг/см³.

Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 6 месяцев.

9.1.2. Приготовление раствора хранения стандарта фуросемида.

Навеску фуросемида около (100 +/- 0,2) мг помещают в мерную колбу на 100 см³, добавляют 80 см³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентраций 1000 мкг/см³.

Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 6 месяцев.

9.2. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандартов фенолфталеина и фуросемида.

Для получения разбавленных калибровочных растворов фенолфталеина и фуросемида с концентрацией 4, 8, 80 и 160 мкг/см³ в ряд колб на 25 см³ помещают 0,1 см³, 0,2 см³, 2,0 см³ и 4,0 см³ раствора хранения стандарта фенолфталеина и фуросемида и доводят объем раствора до 25 см³ метанолом.

Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 2 недель.

Далее строят градуировочные графики по четырем концентрациям 4, 8, 80 и 160 мкг/см³ в линейной зависимости от площади хроматографических пиков фенолфталеина и фуросемида соответствующих калибровочных растворов S (единицы оптической плотности·секунду (е.о.п·с)) и их массовой концентрации C, мкг/см³.

По уравнению зависимости графика с учетом разбавления вычисляют содержание фенолфталеина и/или фуросемида в пробе.

9.2.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов. При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух градуировочных растворов, содержание фенолфталеина и фуросемида в которых входит в диапазон линейности градуировочной характеристики от 4 до 160 мкг/см³. Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация фенолфталеина и фуросемида в пробе при контрольном измерении, мг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора фенолфталеина и фуросемида, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново.

9.3. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ-ДМД анализа.

9.3.1. Приготовление 0,01 М формиатного буфера pH = 3,0 (раствор A).

Для приготовления раствора формиата аммония HCOONH₄ с концентрацией 10 ммоль/дм³ в стакан объемом 500 см³ приливают 400 см³ воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 315 мг формиата аммония. Содержимое переносят в мерную колбу на 500 см³, доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают. Доводят значение pH до 3 муравьиной кислотой с помощью pH-метра. Приготовленный раствор подвижной фазы хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более пяти рабочих дней.

9.3.2. Приготовление рабочего раствора подвижной фазы для ВЭЖХ-ДМД.

Раствор формиатного буфера приготовленного по п. 9.3.1 (раствор A) смешивают с ацетонитрилом по 5.3 (раствор B) в соотношении 65% к 35% по объему. Приготовленный раствор используют в качестве рабочей подвижной фазы. Раствор используют свежеприготовленным.

9.4. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ-МС-анализа.

9.4.1. Приготовление 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в воде (раствор A).

Для приготовления раствора A в мерную колбу объемом 500 см³ приливают 200 см³ воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 0,5 см³ муравьиной кислоты. Раствор доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают. Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более трех месяцев.

9.4.2. Приготовление 0,1%-го раствора муравьиной кислоты в ацетонитриле (раствор B).

Для приготовления раствора B в мерную колбу объемом 500 см³ приливают 200 см³ ацетонитрила и, тщательно перемешивая, прибавляют 0,5 см³ муравьиной кислоты. Раствор доводят ацетонитрилом до метки и перемешивают. Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более трех месяцев.

9.4.3. Приготовление рабочего раствора подвижной фазы для ВЭЖХ-МС.

Растворы A и B, приготовленные по п. 9.4.1 и 9.4.2, смешивают в соотношении 55% к 45%, соответственно, по объему. Приготовленный раствор используют в качестве рабочей подвижной фазы. Раствор используют свежеприготовленным.

9.5. Приготовление образцов к анализу.

9.5.1. Подготовка к анализу образца инкапсулированных БАД.

Содержимое 10 капсул извлекают из оболочки. Берется навеска усредненного образца, соответствующая 1 г. После взвешивания навеску пробы помещают в мерную колбу на 25 см³ и доводят до 25 см³ метанолом. Экстракцию проводят на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 10 мин. Отбирают 10 см³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин. После центрифугирования 1 см³ супернатанта помещают мерную колбу на 25 см³, доводят до 25 см³ метанолом и перемешивают. Отбирают 1,5 см³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ.

9.5.2. Подготовка к анализу образца таблетированных БАД.

Содержимое анализируемого образца БАД в количестве 10 таблеток измельчается в ступке до порошкообразного состояния. Берется навеска усредненного образца, соответствующая 1 г. После взвешивания навеску пробы помещают в мерную колбу на 25 см³, добавляют 25 см³ метанола. Затем проводят экстракцию на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 10 мин. Отбирают 10 см³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин. После центрифугирования 1 см³ супернатанта помещают мерную колбу на 25 см³, доводят до 25 см³ метанолом и перемешивают. Отбирают 1,5 см³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ.

9.5.3. Подготовка к анализу образцов СПП.

Навеску 1 г образца помещают в центрифужную пробирку объемом 15 см³, добавляют 10 см³ метанола и 1 см³ трифторуксусной кислоты. Образец перемешивают и проводят экстракцию на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 10 мин. После этого образец выдерживают в морозильной камере при температуре минус (18 - 20) °C в течение 15 мин. Затем образец доводят до комнатной температуры и центрифугируют в течение 10 мин. После этого супернатант количественно переносят в колбу на 25 см³, доводят метанолом до метки и перемешивают. Затем аликвоту пробы объемом 1 см³ помещают мерную колбу на 25 см³, доводят до 25 см³ метанолом и перемешивают. Отбирают 1,5 см³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ <2>.

--------------------------------

<2> В случае высоких концентраций фенолфталеина и/или фуросемида из объема пробы отбирают аликвоту в 5 см³ и разбавляют метанолом в N раз. Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации.

10.1. Параметры используемых методик.

10.1.1. Условия проведения ВЭЖХ-ДМД.

Условия проведения ВЭЖХ-ДМД приведены в табл. 5.

10.1.2. Условия проведения ВЭЖХ-МС.

Условия детектирования ВЭЖХ-МС приведены в табл. 6.

10.2. Идентификация фенолфталеина и фуросемида.

Идентификацию фенолфталеина и фуросемида осуществляют путем сравнения с абсолютными временами удерживания, УФ-спектрами и массами соответствующего стандарта анализируемых веществ (рис. 3 - 8).

11.1. Расчет содержания в образце фенолфталеина проводят по формуле:

X_фенол - количество фенолфталеина в образце, мг/г;

C_фенол - концентрация фенолфталеина, найденная по калибровочному графику, мкг/см³;

V_к - объем мерной колбы для растворения навески, равный 25 см³;

N - коэффициент разбавления пробы, равный 25;

m_{навески} - навеска образца, взятая на анализ, г.

11.2. Расчет содержания в образце фуросемида проводят по формуле:

X_фур - количество фуросемида в образце, мг/г;

C_фур - концентрация фуросемида, найденная по калибровочному графику, мкг/см³;

V_к - объем мерной колбы для растворения навески, равный 25 см³;

N - коэффициент разбавления пробы, равный 25;

m_{навески} - навеска образца, взятая на анализ, г.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/г

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При превышении расчетного значения предела повторяемости (r), измерение следует провести заново, используя свежеприготовленную пробу.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/г;

- граница абсолютной погрешности, мг/г;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание вещества в пробе менее 2,5 мг/г".

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725 (1 - 6). Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

3. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

4. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

5. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования (ИСО 835-1-81)".

6. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

7. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия (ИСО 3696)".

8. ГОСТ 28311 "Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

9. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

10. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

11. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

12. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

13. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".