"МУК 4.1.3603-20. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика определения сибутрамина в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.07.2020)

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) регулируют порядок определения сибутрамина в биологически активных добавках (далее - БАД) к пище и специализированной пищевой продукции (далее - СПП) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим детектированием на диодной матрице (далее - ДМД) и масс-спектрометрическим (далее - МС) детектированием.

1.2. МУК распространяются на исследования недекларированного добавления синтетического ингибитора обратного захвата серотонина и норадреналина - сибутрамина - в БАД к пище и СПП, в диапазоне от 0,01 до 20 мг/г.

1.3. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящихся в обращении на территории Российской Федерации, в том числе импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы другими испытательными лабораториями (центрами), осуществляющими контроль качества и безопасности биологически активных добавок к пище и продукции пищевой специализированной, аккредитованными в установленном порядке.

1.4. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Тривиальное название - сибутрамин. 1-(1-(4-хлорофенил)циклобутил)-N,N,2,2-тетраметилпропан-1-амин <1>.

--------------------------------

<1> В соответствии с Международным союзом теоретической и прикладной химии (ИЮПАК, англ. International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC).

Структурная формула вещества представлена на рис. 1.

Сибутрамин - лекарственный препарат, предназначенный для проведения комплексной поддерживающей терапии больных с избыточной массой тела при алиментарном ожирении с индексом массы тела от 30 кг/м² и более или с индексом массы тела от 27 кг/м² и более, но при наличии других факторов риска, обусловленных избыточной массой тела (сахарный диабет типа 2, дислипопротеидемия), и являющийся ингибитором обратного захвата нейромедиаторов - серотонина и норадреналина.

Данный фармацевтический препарат рекомендуется применять по назначению врача после сбора полного анамнеза и проведения тщательного общеклинического обследования и для исключения взаимодействия с другими принимаемыми пациентом фармацевтическими препаратами, такими как ингибиторы изофермента CYP3A4, селективные ингибиторы обратного захвата серотонина, рифампицин, карбамазепин, дексаметазон, макролидные антибиотики, фенитоин, фенобарбитал.

Существует проблема фальсификации, связанная с возможным недекларированным добавлением сибутрамина в БАД и СПП.

2.2. Физические свойства: сибутрамин представляет собой кристаллический порошок от белого до кремового цвета. Растворимость в воде: 2,9 мг/мл при pH 5,2. Коэффициент распределения (октанол/вода): 30,9 (pH 5,0). Брутто формула C₁₇H₂₆ClN. Молярная масса сибутрамина составляет 279,85 г/моль, сибутрамина гидрохлорида моногидрата - 334,33 г/моль.

УФ-спектр сибутрамина в метаноле характеризуется максимумом поглощения при длине волны 225 нм.

3.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

4.1. Методика основана на определении сибутрамина в метанольном экстракте образца с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ со спектрофотометрическим ДМД и подтверждением структуры с помощью МС. Идентификацию сибутрамина проводят по совпадению времени удерживания, данным УФ-спектрофотометрии и МС. Количественное определение проводится по данным ВЭЖХ-УФ методом внешней калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения, оборудования, питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными или лучшими характеристиками.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-2017, а также требования, изложенные в технической документации к прибору.

6.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалистов, имеющих высшее или среднее специальное образование и опыт работы в химическо-аналитической лаборатории, владеющих методом ВЭЖХ.

7.1. Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией по отбору проб для определения токсичных элементов для каждого конкретного вида продукции.

8.1. При проведении измерений соблюдаются следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1. Измерениям предшествуют следующие операции: приготовление стандартных и градуировочных растворов, приготовление растворов для экстракции, приготовление подвижной фазы, подготовка проб для анализа.

9.2. Приготовление раствора хранения стандарта сибутрамина. Навеску сибутрамина около 10 мг (далее - точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 10 см³, добавляют 8 см³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем - до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентраций 1 мг/мл.

Приготовленный раствор хранят при температуре 4 - 8 °C в течение 6 месяцев.

9.3. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандарта сибутрамина. Для получения разбавленных калибровочных растворов сибутрамина с концентрацией 0,01; 0,1 мг в мл в ряд колб вместимостью 10 см³ помещают 0,1 см³ и 1 см³ раствора хранения стандарта сибутрамина и доводят объем раствора до 10 см³ метанолом.

Приготовленный раствор хранят при температуре 4 - 8 °C в течение не более 2 недель.

Далее строят градуировочный график по трем концентрациям 0,01; 0,1; 1 мг/мл зависимости оптической плотности (A) калибровочных растворов от концентрации сибутрамина (мг/см³) A = f(C). По градуировочному графику с учетом разбавления вычисляют содержание сибутрамина в пробе.

9.4. Приготовление подвижной фазы.

9.4.1. Приготовление 0,05 М формиатного буфера pH = 4,0. Для приготовления раствора формиата аммония NH₄HCO₂ с концентрацией 10 ммоль в стакан объемом 500 см³ отмеривают 400 см³ воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 1575 мг формиата аммония. Содержимое переносят в мерную колбу вместимостью 500 см³, доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают. Доводят значение pH до 4 с помощью pH-метра.

9.4.2. Приготовление водного раствора формиата аммония (0,01 М NH₄HCO₂). Для приготовления раствора формиата аммония NH₄HCO₂ с концентрацией 10 ммоль в стакан объемом 500 см³ отмеривают 400 см³ воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 315 мг формиата аммония. Содержимое переносят в мерную колбу вместимостью 500 см³, доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают.

9.5. Подготовка образца к анализу (БАД). Содержимое 5 капсул извлекают из оболочки, берется навеска усредненного образца в 1,0 г. После взвешивания навеску пробы помещают в мерную колбу вместимостью 25 см³, добавляют 25 см³ метанола. Экстракцию проводят на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 10 мин. Отбирают 1,5 см³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 5000 g. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ.

9.6. Подготовка образца к анализу (продукция пищевая специализированная). Навеску 1 г образца помещают в мерную колбу вместимостью 25 см³, добавляют 15 см³ метанола. Экстракцию проводят на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 10 мин. Доводят объем до метки метанолом и перемешивают. Отбирают 1,5 см³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 5000 g. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ.

В случае высоких концентраций сибутрамина из объема V (100 см³) отбирают аликвоту в 10 см³ и разбавляют метанолом в N раз. Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации.

10.1. Параметры используемых методик.

10.1.1. Условия проведения ВЭЖХ с использованием диодно-матричного спектрофотометрического детектора. Условия проведения ВЭЖХ приведены в табл. 2.

--------------------------------

<*> При необходимости допускается корректировка соотношения компонентов подвижной фазы с целью обеспечения удовлетворительного разрешения.

10.1.2. Условия проведения ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием. Условия детектирования на масс-спектрометрическом детекторе приведены в табл. 3.

10.2. Идентификация сибутрамина.

Идентификацию сибутрамина осуществляют путем сравнения с абсолютным временем удерживания, УФ-спектрами и массами соответствующего стандарта (рис. 2 - 5).

10.3. Обработка результатов измерения. Расчет содержания в образце сибутрамина проводят по формуле:

где X - количество сибутрамина в образце, мг/г;

S_сиб - площадь пика сибутрамина в образце, полученная с помощью УФ-спектрофотометрического детектора;

S_стд - площадь пика сибутрамина в стандарте, полученная с помощью УФ-спектрофотометрического детектора;

V - объем раствора пробы, см³;

C - концентрация стандарта сибутрамина, найденная по калибровочному графику, мг/см³;

m_{навески} - навеска образца, взятая на анализ, г;

N - коэффициент разбавления пробы.

Результат анализа представляют в виде:

где X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/г;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/г".

10.4. Обработка результатов измерения.

10.4.1. Проверка приемлемости результатов параллельных определений. Определение содержания сибутрамина в каждом образце проводится в 2 параллельных измерениях. Вывод о допустимости расхождения между параллельными измерениями определяют на основании предела повторяемости (r) по формуле:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/г.

При превышении расчетного значения предела повторяемости (r), измерение следует провести заново, используя свежеприготовленную пробу.

11.1. Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/г;

- граница абсолютной погрешности методики.

12.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения промежуточной прецизионности и показателя правильности.