"МУК 4.1.3776-22. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика определения синефрина и октопамина в биологически активных добавках к пище и специализированной пищевой продукции. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 07.06.2022)

1. Разработаны ФГБУН "ФИЦ питания и биотехнологии" (В.А. Тутельян, К.И. Эллер, И.Б. Перова, А.В. Мусатов,).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 7 июня 2022 г.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (далее - ВЭЖХ-ДМД) и масс-спектрометрическим детектором (далее - ВЭЖХ-МС) для определения массовых концентраций синефрина и октопамина в биологически активных добавках (далее - БАД) к пище и специализированной пищевой продукции (далее - СПП) в диапазоне от 0,05 до 30,0 мг/г.

1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы организациями, аккредитованными в установленном порядке на проведение исследований продовольственного сырья, пищевых продуктов.

1.3. МУК носят рекомендательный характер.

2.1. Рациональные названия: синефрин - (+/-)-(4-[1-гидрокси-2-(метиламино)этил]фенол, октопамин - (+/-)-4-(2-амино-1-гидрокси-этил)фенол (в виде гидрохлорида). Химические названия и химические формулы веществ изображены на рис. 1.

Синефрин и октопамин представляют собой порошки или кристаллы от белого до светло-желтого и от светло-бежевого до бежевого цвета. Свободные октопамин и синефрин малорастворимы в воде, соответствующие гидрохлориды растворимы в воде на уровне 40 - 50 мг/мл. Молярная масса синефрина составляет 167,21 г/моль, октопамина - 153,18 г/моль.

УФ-спектры синефрина и октопамина в метаноле характеризуются максимумами поглощения при длинах волн 226 нм и 276 нм.

Синефрин и октопамин применяются в БАД к пище и СПП для контроля массы тела и улучшения спортивных результатов.

3.1. Методика основана на определении синефрина и октопамина методом ион-парной ОФ ВЭЖХ-ДМД с подтверждением структуры с помощью ВЭЖХ-МС. Подготовка пробы включает в себя экстракцию водно-метанольным раствором. Идентификацию синефрина и октопамина проводят по совпадению времен удерживания, УФ-спектров и данных МС. Количественное определение проводится по данным ВЭЖХ-ДМД методом внешней калибровки.

4.1. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

5.1. При выполнении измерений и подготовке проб применяют средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы, приведенные в табл. 2 - 4.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на прибор.

6.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать гигиенических нормативов.

6.3. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалистов, имеющих высшее или среднее специальное образование, имеющих опыт работы в химическо-аналитической лаборатории, владеющих методом ВЭЖХ.

7.1. Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией по отбору проб с целью определения токсичных элементов для каждого конкретного вида продукции.

8.1. При проведении измерений соблюдаются следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 15 - 30 °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9.1.1. Приготовление растворов хранения стандартов синефрина и октопамина.

9.1.2. Приготовление раствора хранения стандарта синефрина.

Навеску синефрина (25 +/- 0,2) мг помещают в мерную колбу на 50 см³, добавляют 40 см³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентраций 0,5 мг/см³.

Приготовленный раствор хранят при температуре плюс (4 - 8) °C не более 12 месяцев.

9.1.3. Приготовление раствора хранения стандарта октопамина.

Навеску октопамина гидрохлорида (31 +/- 0,2) мг помещают в мерную колбу на 50 см³, добавляют 40 см³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентрацией 0,5 мг/см³.

Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 12 месяцев.

9.2. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандартов синефрина и октопамина.

9.2.1. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандарта синефрина.

Для получения разбавленных градуировочных растворов синефрина с концентрацией 0,001; 0,01; 0,1 мг в см³ в ряд колб на 50 см³ помещают 0,1 см³, 1 см³ и 10 см³ раствора хранения стандарта синефрина и доводят объем раствора до 50 см³ метанолом.

Приготовленные растворы хранят при температуре 4 - 8 °C не более 3 месяцев.

Далее строят график зависимости площадей пиков (S) градуировочных растворов от концентрации синефрина (мг/см³) A = f(C) по четырем точкам 0,001; 0,01; 0,1; 0,5 мг/см³. По уравнению зависимости графика с учетом разбавления вычисляют содержание синефрина в пробе.

9.2.2. Приготовление градуировочных рабочих растворов стандарта октопамина.

Для получения разбавленных градуировочных растворов октопамина с концентрацией 0,001; 0,01; 0,1 мг в см³ в ряд колб на 50 см³ помещают 0,1 см³, 1 см³ и 10 см³ раствора хранения стандарта октопамина и доводят объем раствора до 50 см³ метанолом.

Приготовленные растворы хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 3 месяцев.

Далее строят график зависимости площадей пиков (S) градуировочных растворов от концентрации октопамина (мг/см³) A = f(C) по четырем точкам 0,001; 0,01; 0,1; 0,5 мг/см³. По уравнению зависимости графика с учетом разбавления вычисляют содержание октопамина в пробе.

9.2.3. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов. При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух градуировочных растворов, содержание синефрина и октопамина в которых входит в диапазон линейности градуировочной характеристики от 0,001 до 0,5 мг/см³. Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация синефрина или октопамина в пробе при контрольном измерении, мг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора синефрина или октопамина, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново.

9.3. Приготовление подвижной фазы.

9.3.1. Приготовление водного раствора формиата аммония (10 ммоль NH₄HCO₂).

Для приготовления раствора формиата аммония NH₄HCO₂ с концентрацией 10 ммоль в стакан объемом 500 см³ отмеряют 400 см³ воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 315,3 мг формиата аммония. Содержимое переносят в мерную колбу на 500 см³, доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают. Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 месяца.

9.3.2. Приготовление водного раствора формиата аммония (20 ммоль NH₄HCO₂) и гексансульфоновой кислоты (5 ммоль).

Для приготовления раствора формиата аммония NH₄HCO₂ с концентрацией 20 ммоль и гексансульфоновой кислоты с концентрацией 5 ммоль в стакан объемом 1000 см³ отмеряют 800 см³ воды для лабораторного анализа и, тщательно перемешивая, прибавляют 1261,2 мг формиата аммония и 941,2 мг натриевой соли гексансульфоновой кислоты. Содержимое переносят в мерную колбу на 1000 см³, доводят водой для лабораторного анализа до метки и перемешивают. Приготовленный раствор хранят при температуре плюс 4 - 8 °C не более 1 месяца.

9.3.3. Подготовка образцов сухих БАД к пище и СПП к анализу.

Содержимое 5 капсул извлекают из оболочки, 5 таблеток измельчаются в ступке, берется навеска 1 г усредненного образца. Навеску образца помещают в мерную колбу на 50 см³, добавляют 40 см³ смеси метанол - вода (50 : 50). Экстракцию проводят на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 15 мин, затем доводят до метки смесью метанол - вода (50 : 50), перемешивают. Отбирают 1,5 см³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 5000 g. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ <1>.

--------------------------------

<1> В случае высоких концентраций синефрина из объема V (50 см³) отбирают 5 см³ аликвоты и разбавляют смесью метанол - вода (50 50) в N раз. Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации.

9.3.4. Подготовка образцов жидких БАД к пище и СПП к анализу.

К 5 см³ аликвоты образца добавляют 5 см³ метанола, перемешивают. Отбирают 1,5 см³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 5000 g. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ <2>.

--------------------------------

<2> В случае высоких концентраций синефрина из объема пробы отбирают 5 см³ аликвоты и разбавляют смесью метанол - вода (50 50) в N раз Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации

10.1. Параметры используемых методик.

10.1.1. Условия проведения ион-парной ОФ ВЭЖХ-ДМД.

Условия проведения ОФ ВЭЖХ-ДМД приведены в таблице 5.

10.1.2. Условия проведения ВЭЖХ-МС.

Условия детектирования ВЭЖХ-МС приведены в табл. 6.

10.2. Идентификация синефрина и октопамина.

Идентификацию синефрина и октопамина осуществляют путем сравнения с абсолютным временем удерживания, УФ-спектрами и массами соответствующих стандартов (рис. 2 - 7).

11.1. Расчет содержания синефрина и октопамина в образцах.

Расчет содержания в образце синефрина и октопамина в твердых образцах проводят по формуле:

X - количество синефрина или октопамина в образце, мг/г;

C - концентрация стандарта синефрина или октопамина, найденная по калибровочному графику, мг/см³;

V - объем раствора пробы, см³;

N - коэффициент разбавления образца;

m_{навески} - навеска образца, взятая на анализ, г.

Расчет содержания в образце синефрина и октопамина в жидких образцах проводят по формуле:

X - количество синефрина или октопамина в образце, мг/см³;

C - концентрация стандарта синефрина или октопамина, найденная по калибровочному графику, мг/см³;

2 - разведение образца метанолом;

N - коэффициент разбавления образца.

12.1. За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/г (мг/см³);

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При превышении расчетного значения предела повторяемости (r) измерение следует провести заново, используя свежеприготовленную пробу.

13.1. Результат анализа представляют в виде:

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/г (мг/см³),

- граница абсолютной погрешности, мг/г (мг/см³);

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "Содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/г (мг/см³)".

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6 (1 - 6). Периодичность и формы контроля определяются руководством по качеству.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. ГОСТ Р 53228 "Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания".

3. ГОСТ 1770 "Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия".

4. ГОСТ 25336 "Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры".

5. ГОСТ 29227 "Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования (ИСО 835-1-81)".

6. ГОСТ Р 58144 "Вода дистиллированная. Технические условия".

7. ГОСТ Р 52501 "Вода для лабораторного анализа. Технические условия (ИСО 3696)".

8. ГОСТ 28311 "Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний".

9. ГОСТ Р ИСО 5725-(1 - 6) "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

10. ГОСТ 12.1.004 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования".

11. ГОСТ 12.1.007 "Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности".

12. ГОСТ 12.4.009 "Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание".

13. ГОСТ 12.1.019 "Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты".