"МУК 4.1.3331-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой доли синтетических ингибиторов фосфодиэстеразы-5 (тадалафила, варденафила и силденафила) в биологически активных добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым и масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2016)

1. Разработаны: ФГБНУ "НИИ питания" (В.А. Тутельян, К.И. Эллер, В.В. Бессонов, И.Б. Перова, А.А. Жогова, А.П. Воробьев) и ФГБОУ ВПО "Российский университет дружбы народов" (С.В. Орлова, О.Г. Потанина, С.В. Горяинов, Е.А. Никитина, В.А. Ивлев, Г.А. Калабин).

2. Утверждены: руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защите прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой "15" февраля 2016 года.

3. Введены впервые.

1.1. Настоящие методические указания (далее - МУК) предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящихся в обращении на территории Российской Федерации, в том числе импортируемых в Российскую Федерацию, а также могут быть использованы другими испытательными лабораториями (центрами), осуществляющими контроль качества и безопасности биологически активных добавок к пище, аккредитованными в соответствии с требованиями Федерального закона от 28.12.2013 N 412-ФЗ "Об аккредитации в национальной системе аккредитации".

1.2. Настоящие МУК распространяются на исследования недекларированного добавления синтетических ингибиторов фосфодиэстеразы-5 (тадалафила, варденафила и силденафила) в некоторых биологически активных добавках к пище и носят рекомендательный характер.

Настоящие МУК регулируют порядок определения синтетических ингибиторов фосфодиэстеразы-5 (тадалафила, варденафила и силденафила) в БАД к пище методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием в диапазоне измерений от 0,2 до 50 мг/г.

Общепринятые названия:

Тадалафил CAS N: 171596-29-5;

Силденафила цитрат CAS N: 171599-83-0;

Варденафила гидрохлорид CAS N: 330808-88-3.

Химические названия и химические формулы веществ:

1. Тадалафил - (6R,12aR)-6-(1,3-Бензодиоксол-5-ил)-2-метил-2,3,6,7,12,12a-гексагидро-2-метилпиразино[1',2':1,6]пиридо[3,4-b]индол-1,4-дион.

Химическая формула (рисунок 1);

2. Силденафил - (1-[[3-(6,7-Дигидро-1-метил-7-оксо-3-пропил-1Н-пиразоло[4,3-альфа]пиримидин-5-ил)-4-этоксифенил]сульфонил]пиперазин (в форме цитрата).

Химическая формула (рисунок 2);

3. Варденафил - 1-[[3-(1,4-Дигидро-5-метил-4-оксо-7-пропилимидазо[5,1-f][1,2,4]триазин-2-ил)-4-этоксифенил]сульфонил]-4-этилпиперазин (в форме моногидрохлорида).

Химическая формула (рисунок 3).

Тадалафил, силденафил, варденафил - фармацевтические препараты, предназначенные для лечения эректильной дисфункции и являющиеся селективными ингибиторами специфической фосфодиэстеразы типа 5 (ФДЭ5) циклического гуанозин монофосфата (цГМФ).

Данные фармацевтические препараты рекомендуется применять по назначению врача после сбора полного анамнеза и проведения тщательного урологического и общеклинического обследования, особенно у больных с сопутствующими сердечно-сосудистыми заболеваниями, а также для исключения взаимодействия с другими принимаемыми пациентом фармацевтическими препаратами (в частности, органическими нитратами).

Существует проблема фальсификации, связанная с возможным недекларированным присутствием тадалафила, силденафила и варденафила в некоторых биологических активных добавках к пище (далее - БАД).

Физические свойства: тадалафил, силденафил и варденафил представляют собой белые кристаллические порошки с температурой плавления 276 - 279 °C, 185 - 187 °C и 191 - 193 °C соответственно. Тадалафил, силденафил и варденафил хорошо растворяются в метаноле.

УФ-спектр тадалафила в метанольном растворе характеризуется максимумом поглощения при длине волны 284 нм и 291 нм. Спектр метанольного раствора стандарта тадалафила приведен на рис. 4. Молекулярная масса тадалафила 389,4 г/моль, молярная экстинкция при максимуме поглощения .

УФ-спектр силденафила (в форме цитрата) в метанольном растворе характеризуется максимумом поглощения при длине волны 292 нм. Спектр метанольного раствора стандарта силденафила приведен на рис. 5. Молекулярная масса силденафила 474,6 г/моль (силденафила цитрата 666,7 г/моль), молярная экстинкция при максимуме поглощения .

УФ-спектр варденафила (в форме гидрохлорида) в метанольном растворе характеризуется максимумом поглощения при длине волны 242 нм. Спектр метанольного раствора стандарта варденафила приведен на рис. 6. Молекулярная масса варденафила 488,6 г/моль (варденафила гидрохлорида 524,1 г/моль), молярная экстинкция при длине волны .

4.1.1. Принцип метода.

Методика основана на определении тадалафила (далее - ТДЛ), силденафила (далее - СЛД) и варденафила (далее - ВРД) методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ) с УФ-спектрофотометрическим детектором с подтверждением структуры с помощью масс-селективного детектора.

4.1.2. Метрологические характеристики метода, установленные для разных концентраций тадалафила, силденафила и варденафила в пробе, приведены в таблице 1.

Тадалафил (стандарт, не менее 99%);

Силденафила цитрат (стандарт, не менее 98%);

Варденафила гидрохлорид (стандарт, не менее 90%);

- метанол для ВЭЖХ;

- ацетонитрил для ВЭЖХ;

- вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72;

- раствор формиата аммония 5М или формиат аммония квалификации ХЧ;

- система жидкостной хроматографии, оснащенная насосом, УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице и масс-детектором;

- хроматографическая колонка для обращенно-фазовой хроматографии с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом (линейные размеры 250 мм x 4,6 мм, размер частиц 5 мкм);

- центрифуга для пробирок объемом не менее 1,5 см³ и относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 10000;

- ультразвуковая водяная баня;

- pH-метр;

- весы лабораторные аналитические с наибольшим пределом взвешивания 110 г и дискретностью 0,0001 г, класс точности специальный (I) по ГОСТ Р 53228-2008;

- колбы мерные наливные объемом 50, 100, 500 и 1000 см³ по ГОСТ 1770-74;

- стаканы по ГОСТ 25336-82 вместимостью 500 см³;

- цилиндры мерные лабораторные с носиком 2-го класса точности вместимостью 100 и 500 см³ по ГОСТ 1770-74;

- пипетки 1-2-2-1, 1-2-2-2, 1-2-2-5 по ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81);

- автоматические пипетки с переменным объемом 0,1 - 1,0 см³;

- полимерные пробирки объемом 1,5 см³ с герметичной крышкой.

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов, следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией по отбору проб для определения токсичных элементов для каждого конкретного вида продукции.

4.5.1. Приготовление раствора стандарта тадалафила.

Навеску тадалафила около 20 мг (здесь и далее: точная навеска) помещают в мерную колбу на 100 см³, добавляют 70 см³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентраций 200 мкг/мл.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение 6-ти месяцев.

4.5.2. Приготовление рабочего раствора стандарта тадалафила с концентрацией 20 мкг/см³ (срок хранения 14 дней).

Мерной пипеткой переносят 5 см³ раствора хранения стандарта тадалафила в мерную колбу на 50 см³, доводят объем до метки метанолом и перемешивают.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение не более 2-х недель. Концентрацию рабочего раствора подтверждают с помощью УФ-спектрофотометрии, используя коэффициент молярной экстинкции при :

,

где D - оптическая плотность раствора,

- коэффициент молярной экстинкции тадалафила (16500 л x моль^-1 x см^-1)

Пересчет на концентрацию C в мг/л проводится по формуле:

C = Cm * 1000 * 389,4 (в упрощенном виде C = 23,6 * D, мг/л)

4.5.3. Приготовление раствора стандарта силденафила.

Навеску силденафила цитрата около 28 мг (соответствует 20 мг силденафила) помещают в мерную колбу на 50 см³, добавляют 30 см³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентрацией 400 мкг/мл.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение не более 6-ти месяцев.

4.5.4. Приготовление рабочего раствора стандарта силденафила с концентрацией 40 мкг/см³ (срок хранения 14 дней).

Мерной пипеткой переносят 5 см³ раствора хранения стандарта силденафила в мерную колбу на 50 см³, доводят объем до метки метанолом и перемешивают.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение не более 2-х недель. Концентрацию рабочего раствора подтверждают с помощью УФ-спектрофотометрии, используя коэффициент молярной экстинкции при .

Расчет концентрации рабочего раствора проводят аналогично пункту 4.5.2.

При величине коэффициента молярной экстинкции для силденафила и молекулярной массе 474,6 г/моль концентрация рабочего раствора равна:

C = 34,4 * D (мг/л)

4.5.5. Приготовление стандартного раствора варденафила.

Навеску варденафила гидрохлорида около 24 мг (соответствует 20 мг варденафила) помещают в мерную колбу на 50 см³, добавляют 30 см³ метанола, перемешивают до полного растворения, доводят объем до метки метанолом и перемешивают, получая раствор хранения с концентрацией 400 мкг/мл.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение не более 6-ти месяцев.

4.5.6. Приготовление рабочего раствора стандарта варденафила с концентрацией 40 мкг/см³ (срок хранения 14 дней).

Мерной пипеткой переносят 5 см³ раствора хранения стандарта варденафила в мерную колбу на 50 см³, доводят объем до метки метанолом и перемешивают.

Приготовленный раствор хранят при температуре 5 - 8 °C в течение не более 2-х недель.

Расчет концентрации рабочего раствора проводят аналогично пункту 4.5.2.

При величине коэффициента молярной экстинкции для варденафила и молекулярной массе 488,6 г/моль концентрация рабочего раствора равна:

C = 56,7 * D (мг/л)

4.5.7. Приготовление подвижной фазы.

Для приготовления раствора формиата аммония с концентрацией 10 ммоль в стакан объемом 500 см³ отмеривают 400 см³ воды дистиллированной и, тщательно перемешивая, прибавляют 1,0 см³ 5М раствора формиата аммония. Содержимое переносят в мерную колбу на 500 см³, доводят водой дистиллированной до метки и перемешивают.

При использовании формиата аммония квалификации ХЧ навеску массой 630 мг переносят в мерную колбу объемом 1000 см³, доводят водой дистиллированной до метки и тщательно перемешивают до полного растворения навески.

Для приготовления подвижной фазы в мерную колбу объемом 1000 см³ отмеривают 400 см³ раствора формиата аммония с концентрацией 10 ммоль, и, тщательно перемешивая, добавляют 600 см³ ацетонитрила до метки. Подвижную фазу фильтруют под вакуумом с применением мембранного фильтра с диаметром пор <*>.

--------------------------------

<*> При необходимости допускается корректировка соотношения компонентов подвижной фазы с целью обеспечения удовлетворительного разрешения.

4.5.8. Подготовка образца к анализу.

При анализе БАД таблетированные формы (5 таблеток) подвергают измельчению, в случае капсулированных препаратов содержимое 5 капсул извлекают из оболочки (при необходимости оболочки капсул измельчают и добавляют к содержимому капсул). Таким же способом можно подвергнуть анализу сырье для производства БАД или оболочки капсул (5 - 10 капсул) <*>. На анализ берется навеска усредненного образца, соответствующая массе 1,0 г. После взвешивания, навеску пробы помещают в мерную колбу на 100 см³, добавляют 100 см³ смеси метанол:вода (6:4, v:v) (объем V). Экстракцию проводят на ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 20 мин. Отбирают 1,5 см³ экстракта в центрифужную пробирку. Пробирку центрифугируют в течение 10 мин с относительной силой центрифугирования (RCF) не менее 10000. Надосадочную жидкость анализируют с помощью ВЭЖХ.

--------------------------------

<*> В случае высоких концентраций ингибиторов ФДЭ-5 ("зашкаливание" на хроматограмме) из объема V (100 см³) отбирают аликвоту в 10 см³ и разбавляют смесью метанол:вода (6:4, v:v) в N раз. Разбавление учитывают в конечной формуле расчета концентрации (пункт 4.7).

4.6.1. Условия проведения ВЭЖХ.

Условия проведения ВЭЖХ приведены в таблице 2.

--------------------------------

<*> При необходимости допускается корректировка соотношения компонентов подвижной фазы с целью обеспечения удовлетворительного разрешения.

4.6.2. Условия детектирования на времяпролетном масс-спектрометрическом детекторе.

Условия детектирования на времяпролетном масс-спектрометрическом детекторе приведены в таблице 3.

4.6.3. Условия детектирования на тройном квадрупольном масс-спектрометрическом детекторе.

Условия детектирования на тройном квадрупольном масс-спектрометрическом детекторе приведены в таблице 4.

4.6.4. Идентификация ТДЛ, СЛД и ВРД.

Идентификацию компонентов на хроматограмме осуществляют путем сравнения с абсолютным временем удерживания, УФ-спектрами и массами (характеристичными "переходами") соответствующих стандартов.

Типичные хроматограммы и масс-спектры приведены на рисунках 7 - 11.

Расчет содержания в образце ТДЛ, СЛД и ВРД проводят по формуле:

где:

X - количество ТДЛ, СЛД или ВРД в образце, мг/г;

S_{ТДЛ(ВРД,СЛД)} - площадь ТДЛ, СЛД или ВРД в образце, полученная с помощью УФ-спектрофотометрического детектора;

S_СТД - площадь стандарта ТЛД, СЛД или ВРД, полученная с помощью УФ-спектрофотометрического детектора;

V - объем раствора пробы, см³;

C - концентрация стандарта ТЛД, СЛД или ВРД, мг/см³;

m_{навески} - навеска образца, взятая на анализ, г.

N - коэффициент разбавления пробы

Результат анализа представляют в виде:

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,2 мг/г". <*>

--------------------------------

<*> - 0,2 мг/г - предел обнаружения.

4.8.1. Проверка приемлемости результатов параллельных определений.

Определение содержания тадалафила, силденафила и варденафила в каждом образце проводится в 2-х параллельных измерениях. Вывод о допустимости расхождения между параллельными измерениями определяют на основании предела повторяемости (r) по формуле:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/г

При превышении расчетного значения предела повторяемости (r), измерение следует провести заново, используя свежеприготовленную пробу.

4.8.2. Проверка лабораторной воспроизводимости

Вывод о допустимости расхождения между разными лабораторными измерениями одной и той же пробы определяют на основании предела воспроизводимости (R) по формуле:

где X₁, X₂ - результаты разных лабораторных определений, мг/г

При превышении расчетного значения предела воспроизводимости (R), измерение следует провести заново, используя новую пробу.

4.8.3. Оперативный контроль проведения измерения с использованием метода добавок.

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы БАД к пище (содержащие тадалафил (силденафил или варденафил) в концентрации не менее нижнего предела количественного определения. Пробу разделяют ее на две равные части. Одну оставляют без изменений, а к другой добавляют стандартный раствор тадалафила (силденафила или варденафила) в таком количестве, чтобы его массовая доля увеличилась на 50 - 100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы и пробы с добавкой.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой (C'_рк), пробы без добавки (C_рк) и величиной добавки (C_добрк) с нормативом оперативного контроля (K). Норматив оперативного контроля (K) рассчитывают по формуле:

Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия:

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.

Метод ВЭЖХ-УФ-спектрофотометрии предоставляет необходимый предел обнаружения и достаточную селективность анализа. При получении отрицательных результатов ВЭЖХ-УФ анализа образец рассматривается как свободный от наличия остатков тадалафила, силденафила или варденафила.

При положительных результатах ВЭЖХ-УФ анализа необходимо обязательное подтверждение наличия тадалафила, силденафила или варденафила с помощью ВЭЖХ-масс-спектрометрии.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалистов, имеющих высшее или среднее специальное образование, имеющих опыт работы в химическо-аналитической лаборатории, владеющих методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и навыками в области хроматомасс-спектрометрии.

При выполнении анализов необходимо соблюдать требования охраны труда при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76 и ГОСТ 12.4.103-83.

Помещение, в котором проводят анализы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021-75.

Электробезопасность при работе с электроустановками - по ГОСТ 12.2.007.0-75 и по ГОСТ Р 12.1.019-2009.

Организация обучения работающих безопасности труда - по Постановлению Минтруда РФ и Минобразования РФ от 13 января 2003 года N 1/29 "Об утверждении Порядка обучения по охране труда и проверки знаний требований охраны труда работников организаций".

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по постановлению Правительства РФ от 25 апреля 2012 года N 390 "О противопожарном режиме" и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.

Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005-88.

Условия измерений (температура, влажность, напряжение сети, атмосферное давление и пр.) должны соответствовать требованиям, изложенным в паспортах или иных документах на используемое оборудование, материалы и реактивы.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. СП 1.1.1058-01 "Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий".

3. СП 1.1.2193-07 "Изменения и дополнения к СП 1.1.1058-01 "Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий".

4. СанПиН 2.3.2.1290-03 "Гигиенические требования к организации производства и оборота биологически активных добавок к пище (БАД)".

5. ГОСТ Р 8.563-2009 ГСИ. Методики (методы) измерений.

6. ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения.

7. ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений.

8. ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений.

9. Tadalafil (англ.). Drugs.com.

10. Тадалафил. Энциклопедия лекарств и товаров аптечного ассортимента. РЛС Патент. - Инструкция, применение и формула.

11. Sildenafil, Tadalafil, Vardenafil - Labels updated with NAION information. FDA Statement. United States Food and Drug Administration, 8 July 2005 (англ.). WHO Pharmaceuticals Newsletter 2005, No. 03.