"МУК 4.1.3317-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой концентрации [(1R)-3-метил-1-[[(2S)-1-оксо-3-фенил-2-[(пиразинил-карбонил)амино]пропил]амино]бутил]бороновой кислоты (бортезомиб) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.12.2015)

Сборник методических указаний "Измерение концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны" (выпуск 57) разработан с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций вредных веществ их предельно допустимым концентрациям (ПДК) и ориентировочным безопасным уровням воздействия (ОБУВ) и является обязательным при осуществлении санитарного контроля.

Включенные в данный сборник методические указания по контролю вредных веществ в воздухе рабочей зоны разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.016-79 "Воздух рабочей зоны. Требования к методикам измерения концентраций вредных веществ" с изм. 1, ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" с изм. 1, ГОСТ Р 8.563-09 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений", ГОСТ Р ИСО 5725-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Методики выполнены с использованием современных методов исследования, метрологически аттестованы и дают возможность контролировать концентрации химических веществ на уровне и ниже их ПДК и ОБУВ в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны" и ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны" и дополнениях к ним.

Методические указания по измерению массовых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, санитарных лабораторий промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, а также научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств.

Методические указания подготовлены коллективом авторов ФГБНУ "Научно-исследовательский институт медицины труда" (Л.Г. Макеева - руководитель, Н.С. Горячев, Е.М. Малинина, Е.Н. Грицун, Н.Л. Полуэктова).

Разработаны сотрудниками ООО "Алгама" (Н.П. Сергеюк), ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (Н.Г. Иванов), АО "ВНЦ БАВ" (М.И. Голубева, Л.И. Крымова).

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 01.00225/205-4-15.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерений массовой концентрации бортезомиба в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,001 - 0,01 мг/м³. Методические указания носят рекомендательный характер.

Бортезомиб

Эмпирическая формула: C₁₉H₂₅BN₄O₄.

Молекулярная масса: 384,24.

Регистрационный номер CAS: 179324-69-7.

Бортезомиб - кристаллический порошок от белого до бежевого цвета, без запаха, с температурой плавления 124 - 140 °C, практически нерастворим в спирте этиловом, мало растворим в воде, легко растворим в спирте метиловом.

Хранение в морозильной камере при температуре минус (20 +/- 5) °C в защищенном от света месте.

Бортезомиб представляет собой модифицированную борную кислоту.

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

Бортезомиб - цитостатический противоопухолевый лекарственный препарат, чрезвычайно опасен при остром и хроническом воздействии при всех путях поступления в организм: при ингаляции, контакте с кожей и слизистыми оболочками, заглатывании. Органами-мишенями являются: желудочно-кишечный тракт, кровь (снижение гемоглобина, анемия, уменьшение содержания клеток крови и тромбоцитов), печень, почки, периферическая нервная система, репродуктивная система.

Для бортезомиба ПДК в воздухе рабочей зоны не устанавливается, в перечень ПДК бортезомиб вносится с пометкой "++", 1 класс опасности. Контроль бортезомиба в воздухе рабочей зоны следует проводить на уровне чувствительности метода не менее 0,001 мг/м³.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой при выполнении измерений массовой концентрации бортезомиба метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности P = 0,95).

Измерение массовой концентрации бортезомиба выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым спектрофотометрическим (УФ) детектированием. Метод основан на разделении бортезомиба и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом, с последующей регистрацией бортезомиба с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации бортезомиба.

Измерение проводят при длине волны 270 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.

Минимально определяемое количество бортезомиба в анализируемом объеме раствора пробы - 0,01 мкг.

Нижний предел измерений массовой концентрации бортезомиба в воздухе 0,001 мг/м³ (при отборе 1 000 дм³ воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе бортезомиба. Определению не мешают вспомогательные вещества: маннитол.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004-90.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, имеющий высшее образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедший обучение и владеющий техникой анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, освоивший метод анализа в процессе тренировки и уложившийся в нормативы оперативного контроля при проведении процедур контроля погрешности анализа.

8.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

8.2. Выполнение измерений с использованием жидкостного хроматографа проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб воздуха.

Перед взвешиванием бортезомиб вынимают из морозильной камеры и помещают в эксикатор на 2 ч. Процесс взвешивания необходимого количества бортезомиба должен осуществляться не более чем 30 мин, после чего оставшуюся часть вещества убирают обратно в морозильную камеру.

Для приготовления всех растворов используют мерную посуду, обернутую алюминиевой фольгой. Время приготовления растворов не должно превышать 30 мин.

9.1.1. Основной раствор бортезомиба с массовой концентрацией 1 000 мкг/см³ готовят растворением (0,05236 +/- 0,00015) г бортезомиба в подвижной фазе А в мерной колбе вместимостью 50 см³, перемешивают до растворения.

Раствор хранят в защищенном от света месте при температуре 2 - 8 °C. Срок годности раствора 7 суток.

9.1.2. Рабочий раствор бортезомиба N 1 с массовой концентрацией 100 мкг/см³ готовят разбавлением 5 см³ основного раствора бортезомиба в подвижной фазе А в мерной колбе вместимостью 50 см³, перемешивают до растворения.

Раствор хранят в защищенном от света месте при температуре 2 - 8 °C. Срок годности раствора 7 суток.

9.1.3. Рабочий раствор бортезомиба N 2 с массовой концентрацией 10 мкг/см³ готовят разбавлением 5 см³ рабочего стандартного раствора бортезомиба N 1 в подвижной фазе А в мерной колбе вместимостью 50 см³, перемешивают до растворения.

Раствор хранят в защищенном от света месте при температуре 2 - 8 °C. Срок годности раствора 7 суток.

9.1.4. Приготовление подвижной фазы А

В мерной колбе вместимостью 1 000 см³ смешивают 300 см³ ацетонитрила, 700 см³ воды особо чистой и 1,0 см³ муравьиной кислоты. Подвижную фазу А перед применением фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм и при необходимости дегазируют на ультразвуковой бане в течение 30 мин. Хранят при комнатной температуре. Подвижная фаза А, не использованная в течение 24 часов, требует дополнительной дегазации перед применением. Срок хранения подвижной фазы А две недели.

Подготовку жидкостного хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

Проверка пригодности хроматографической системы.

Хроматографическая система считается пригодной, если выполняется следующее условие: относительное стандартное отклонение, рассчитанное для площади пика бортезомиба, должно быть не более 2%.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания бортезомиба в хроматографируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной калибровки по шести сериям измерений по шести концентрациям вещества в каждой серии растворов согласно табл. 2.

Градуировочные растворы используют в течение суток. Растворы, которые в настоящий момент не используются, хранят в холодильнике (температура от 2 до 8 °C).

На фильтры, помещенные в бюксы, обернутые алюминиевой фольгой, пипеткой вместимостью 1 см³ наносят рабочий раствор бортезомиба N 1 с массовой концентрацией 100 мкг/см³ и рабочий раствор бортезомиба N 2 с массовой концентрацией 10 мкг/см³ в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре и с помощью пипетки вместимостью 5 см³ приливают по 5 см³ подвижной фазы А, периодически помешивая стеклянной палочкой в течение 5 мин для лучшего растворения вещества. Затем фильтры тщательно отжимают, растворы сливают в мерные колбы вместимостью 10 см³, обернутые алюминиевой фольгой. Фильтры снова обрабатывают 5 см³ подвижной фазы А, периодически помешивая стеклянной палочкой в течение 5 мин. Затем фильтры тщательно отжимают и удаляют, растворы сливают в те же колбы и доводят объем до 10,0 см³ подвижной фазой А. Таким образом, объем каждого градуировочного раствора составит 10,0 см³. Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы. Автосемплер покрывают алюминиевой фольгой (если он не обеспечивает защиту от света).

В хроматограф инжектируют по 0,1 см³ каждого из градуировочных растворов.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания бортезомиба в хроматографируемом объеме (мкг).

Подвижная фаза А: смесь ацетонитрила, воды и муравьиной кислоты в соотношении 30:70:0,1 (по объему).

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений по п. 9.3 и анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

где S_изм, S_гр - значение площади пика (приборные единицы) бортезомиба в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

K_гр - норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное измерение этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика не стабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировочной характеристики, предусмотренной методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики прибор градуируют заново.

Отбор проб воздуха проводят в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Руководством Р 2.2.2006-05 (приложение 9) "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", раздел 2 "Контроль соответствия максимальным ПДК".

Одновременно отбирают две параллельные пробы.

Воздух аспирируют через фильтр, помещенный в фильтродержатель, снабженный металлической сеткой. Для определения массовой концентрации бортезомиба на уровне 0,001 мг/м³ отбирают не менее 1 000 дм³ воздуха в течение 10 мин.

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, обернутый алюминиевой фольгой, доставляют к месту проведения анализа в термоконтейнере (при температуре от 2 до 8 °C). Время от начала отбора пробы до проведения анализа - не более 40 мин.

Фильтр с отобранной пробой переносят в бюкс, обернутый алюминиевой фольгой, приливают 5 см³ подвижной фазы А, периодически помешивая стеклянной палочкой в течение 5 мин для лучшего растворения вещества. Затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную колбу вместимостью 10 см³, обернутую алюминиевой фольгой. Фильтр повторно обрабатывают 5 см³ подвижной фазы А, помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 5 мин, затем фильтр тщательно отжимают и удаляют. Растворы объединяют и доводят объем до 10,0 см³ подвижной фазой А.

Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы.

Хроматографический анализ выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Количественное определение содержания бортезомиба (в мкг) в анализируемом объеме раствора пробы проводят по предварительно построенной градуировочной характеристике.

Массовую концентрацию бортезомиба в воздухе рабочей зоны C, мг/м³, вычисляют по формуле:

где а - содержание бортезомиба в хроматографируемом объеме раствора пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

B - общий объем раствора пробы, см³;

б - хроматографируемый объем раствора пробы, см³;

V₂₀ - объем воздуха, отобранный для анализа (дм³) и приведенный к стандартным условиям (прилож. 1).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

где C₁, C₂ - результаты параллельных определений массовой концентрации бортезомиба в воздухе рабочей зоны, мг/м³;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики измерений.

Результат количественного химического анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/м³;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация бортезомиба менее 0,001 мг/м³ (более 0,01 мг/м³)".

Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение в морозильной камере при температуре минус (20 +/- 5) °C в защищенном от света месте.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD_0,95 по формуле:

где C_ср1, C_ср2 - средние значения массовой концентрации бортезомиба, полученные в первой и второй лабораториях, мг/м³;

CD_0,95 - значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

Периодичность контроля стабильности результатов выполнения измерений регламентируют в Руководстве по качеству лаборатории.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

Приведение объема воздуха к стандартным условиям при температуре 293 К (20 °C) и атмосферном давлении 101,33 кПа (760 мм рт. ст.):

V_t - объем воздуха, отобранный для анализа, дм³;

P - барометрическое давление, кПа (101,33 кПа = 760 мм рт. ст.);

t - температура воздуха в месте отбора пробы, °C.

Для удобства расчета V₂₀ следует пользоваться таблицей коэффициентов (прилож. 2). Для приведения воздуха к стандартным условиям надо умножить V_t на соответствующий коэффициент.