"МУК 4.1.3314-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений массовой концентрации 40-O-(2-гидроксиэтил)-рапамицина (эверолимус) в воздухе рабочей зоны методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.12.2015)

Сборник методических указаний "Измерение концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны" (выпуск 57) разработан с целью обеспечения контроля соответствия фактических концентраций вредных веществ их предельно допустимым концентрациям (ПДК) и ориентировочным безопасным уровням воздействия (ОБУВ) и является обязательным при осуществлении санитарного контроля.

Включенные в данный сборник методические указания по контролю вредных веществ в воздухе рабочей зоны разработаны и подготовлены в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.016-79 "Воздух рабочей зоны. Требования к методикам измерения концентраций вредных веществ" с изм. 1, ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" с изм. 1, ГОСТ Р 8.563-09 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений", ГОСТ Р ИСО 5725-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Методики выполнены с использованием современных методов исследования, метрологически аттестованы и дают возможность контролировать концентрации химических веществ на уровне и ниже их ПДК и ОБУВ в воздухе рабочей зоны, установленных в гигиенических нормативах ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны" и ГН 2.2.5.2308-07 "Ориентировочные безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны" и дополнениях к ним.

Методические указания по измерению массовых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны предназначены для лабораторий центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, санитарных лабораторий промышленных предприятий при осуществлении контроля за содержанием вредных веществ в воздухе рабочей зоны, а также научно-исследовательских институтов и других заинтересованных министерств и ведомств.

Методические указания подготовлены коллективом авторов ФГБНУ "Научно-исследовательский институт медицины труда" (Л.Г. Макеева - руководитель, Н.С. Горячев, Е.М. Малинина, Е.Н. Грицун, Н.Л. Полуэктова).

Разработаны сотрудниками ООО "Алгама" (Н.П. Сергеюк), ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (Н.Г. Иванов), АО "ВНЦ БАВ" (М.И. Голубева, Л.И. Крымова).

Свидетельство о государственной метрологической аттестации N 01.00225/205-6-15.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерений массовой концентрации эверолимуса в воздухе рабочей зоны в диапазоне массовых концентраций 0,001 - 0,01 мг/м³.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Эверолимус

Эмпирическая формула: C₅₃H₈₃NO₁₄.

Молекулярная масса: 958,2.

Регистрационный номер CAS: 159351-69-6.

Эверолимус - от белого до белого с желтоватым оттенком цвета порошок, без запаха, стабилен при нагревании до 130 °C, содержит два активных компонента: 6-членный и 7-членный таутомеры эверолимуса, чувствителен к воздействию света, мало растворим в воде (менее 1 мг/см³), растворим в спирте этиловом 96%-м (7 мг/см³), диметилсульфоксиде (30 мг/см³).

Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль.

Эверолимус - ингибитор пролиферативного сигнала, относится к группе противоопухолевых препаратов. Обладает иммуносупрессивным действием и выраженной кумулятивной активностью.

Для эверолимуса ПДК в воздухе рабочей зоны не устанавливается, в перечень ПДК эверолимус вносится с пометкой "++", 1 класс опасности.

Контроль эверолимуса в воздухе рабочей зоны следует проводить на уровне чувствительности метода не менее 0,001 мг/м³.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой, при выполнении измерений массовой концентрации эверолимуса метрологические характеристики не превышают значений, представленных в табл. 1 (при доверительной вероятности P = 0,95).

Измерение массовой концентрации эверолимуса выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым спектрофотометрическим (УФ) детектированием. Метод основан на разделении эверолимуса и других компонентов анализируемой смеси на хроматографической колонке, заполненной сорбентом с последующей регистрацией эверолимуса с помощью ультрафиолетового детектора. Сигнал детектора прямо пропорционален концентрации эверолимуса.

Измерение проводят при длине волны 275 нм.

Отбор проб проводят с концентрированием на аналитические аэрозольные фильтры.

Минимально определяемое количество эверолимуса в анализируемом объеме раствора пробы - 0,01 мкг.

Нижний предел измерения массовой концентрации эверолимуса в воздухе 0,001 мг/м³ (при отборе 1 000 дм³ воздуха).

Метод специфичен в условиях приготовления препаративных форм на основе эверолимуса. Измерению не мешают вспомогательные вещества: бутилгидрокситолуол, лактозы моногидрат, гипромеллоза, кросповидон, магния стеарат.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1.

6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ должны соблюдаться требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91. Должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Необходимо провести обучение работающих правилам безопасности труда согласно ГОСТ 12.0.004-90.

6.3. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-09 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, имеющий высшее образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедший обучение и владеющий техникой анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, освоивший метод анализа и уложившийся в нормативы оперативного контроля при проведении процедур контроля погрешности анализа.

8.1. Условия приготовления растворов и подготовки проб к анализу:

- относительная влажность воздуха, не более 80%.

8.2. Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед выполнением измерений проводят следующие работы: приготовление растворов, подготовка жидкостного хроматографа, установление градуировочной характеристики, отбор проб.

Ввиду чувствительности эверолимуса к воздействию света для приготовления растворов эверолимуса мерную посуду оборачивают алюминиевой фольгой.

9.1.1. Основной раствор эверолимуса с массовой концентрацией 500 мкг/см³. Основной раствор эверолимуса с массовой концентрацией 500 мкг/см³ готовят растворением (0,02632 +/- 0,00015) г эверолимуса в спирте этиловом 96%-м в мерной колбе вместимостью 50 см³. Раствор устойчив в течение двух суток при хранении в холодильнике или при комнатной температуре в защищенном от света месте.

9.1.2. Рабочий раствор эверолимуса N 1 с массовой концентрацией 100 мкг/см³ готовят разбавлением 10,0 см³ основного раствора эверолимуса спиртом этиловым 96%-м в мерной колбе вместимостью 50 см³. Раствор устойчив в течение двух суток при хранении в холодильнике или при комнатной температуре в защищенном от света месте.

9.1.3. Рабочий раствор эверолимуса N 2 с массовой концентрацией 10 мкг/см³ готовят разбавлением 5,0 см³ рабочего раствора эверолимуса N 1 спиртом этиловым 96%-м в мерной колбе вместимостью 50 см³. Раствор устойчив в течение двух суток при хранении в холодильнике или при комнатной температуре в защищенном от света месте.

9.1.4. Раствор калия фосфорно-кислого однозамещенного 0,002М. Навеску калия фосфорно-кислого однозамещенного в количестве 0,272 г помещают в мерную колбу вместимостью 1 000 см³, содержащую около 500 см³ воды особо чистой, перемешивают, затем доводят объем водой особо чистой до метки. Срок годности раствора 2 недели.

Подготовку жидкостного хроматографа проводят в соответствии с руководством по его эксплуатации.

Проверка пригодности хроматографической системы.

Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия: относительное стандартное отклонение суммы площадей пика 6-членного и пика 7-членного таутомеров эверолимуса, рассчитанное для 6 повторных вводов основного стандартного раствора, должно быть не более 2%.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пиков (приборные единицы) от содержания эверолимуса в хроматографируемом объеме градуировочных растворов, устанавливают по методу абсолютной градуировки по шести сериям измерений по шести концентрациям вещества в каждой серии согласно табл. 2.

Градуировочные растворы используют свежеприготовленные. Растворы устойчивы в течение суток при хранении в холодильнике (температура 2 - 8 °C).

На фильтры, помещенные в бюксы, обернутые алюминиевой фольгой, пипеткой вместимостью 1 см³ наносят рабочий раствор эверолимуса N 1 с массовой концентрацией 100 мкг/см³ и рабочий раствор эверолимуса N 2 с массовой концентрацией 10 мкг/см³ в соответствии с табл. 2. Фильтры подсушивают при комнатной температуре и с помощью пипетки вместимостью 5 см³ приливают по 5 см³ спирта этилового 96%-го и оставляют на 10 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой для лучшего растворения вещества. Затем фильтры тщательно отжимают, растворы сливают в пробирки мерные вместимостью 10 см³, обернутые алюминиевой фольгой. Фильтры повторно обрабатывают 5 см³ спирта этилового 96%-го и оставляют на 10 мин, периодически помешивая стеклянной палочкой, затем фильтры тщательно отжимают и удаляют. Растворы объединяют в мерных пробирках вместимостью 10 см³ и доводят объем до метки спиртом этиловым 96%-м. Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы. Автосемплер покрывают алюминиевой фольгой (если он не обеспечивает защиту от света).

Инжектируют в хроматограф по 0,1 см³ каждого из градуировочных растворов.

По полученным данным строят градуировочную характеристику зависимости площади пика (приборные единицы) от содержания эверолимуса в хроматографируемом объеме (мкг).

Допускается изменять профиль градиента для достижения соответствия критериям пригодности хроматографической системы.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Один раз в год градуировочную характеристику устанавливают заново.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества по п. 9.3 (в начале, середине и в конце измерений) и анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие:

где S_изм, S_гр - значение площади пика (приборные единицы) эверолимуса в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно;

K_гр - норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то выполняют повторное измерение этого образца с целью исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировочная характеристика нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировочной характеристики, предусмотренной методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики прибор градуируют заново.

Отбор проб проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Р 2.2.2006-05 (прилож. 9) "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", раздел 2 "Контроль соответствия максимальным ПДК".

Одновременно отбирают две параллельные пробы.

Воздух аспирируют через фильтр, помещенный в фильтродержатель, снабженный металлической сеткой. Для определения массовой концентрации эверолимуса на уровне 0,001 мг/м³ отбирают не менее 1 000 дм³ воздуха в течение 10 мин.

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, обернутый алюминиевой фольгой, доставляют к месту проведения анализа в термоконтейнере (при температуре от 2 до 8 °C).

Отобранные пробы можно хранить в бюксах в течение суток в холодильнике.

Фильтр с отобранной пробой помещают в бюкс, обернутый алюминиевой фольгой, приливают 5 см³ спирта этилового 96%-го, помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 10 мин для лучшего растворения вещества. Затем фильтр тщательно отжимают, раствор сливают в мерную пробирку вместимостью 10 см³, обернутую алюминиевой фольгой. Фильтр повторно обрабатывают 5 см³ спирта этилового 96%-го, помешивая при этом стеклянной палочкой в течение 10 мин, затем тщательно отжимают и удаляют. Раствор сливают в ту же пробирку, объем раствора доводят до метки спиртом этиловым 96%-м. Далее растворы фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм в хроматографические виалы.

Хроматографический анализ выполняют в тех же условиях, что и хроматографирование градуировочных растворов.

Регистрируют не менее двух хроматограмм для каждой пробы, соблюдая все условия, требуемые для градуировки хроматографической системы.

Количественное определение содержания эверолимуса (в мкг) в анализируемом объеме раствора пробы проводят по предварительно построенной градуировочной характеристике.

Примечание. Фильтрование растворов анализируемых проб проводится для удаления нерастворимых в спирте этиловом 96%-м вспомогательных веществ, входящих в состав препаративных форм эверолимуса.

Массовую концентрацию эверолимуса в воздухе рабочей зоны C, мг/м³, вычисляют по формуле:

где а - содержание эверолимуса в анализируемом объеме раствора пробы, найденное по градуировочной характеристике, мкг;

B - общий объем раствора пробы, см³;

б - хроматографируемый объем раствора пробы, см³;

V₂₀ - объем воздуха, отобранный для анализа (дм³) и приведенный к стандартным условиям (прилож. 1).

За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:

где C₁, C₂ - результаты параллельных определений массовой концентрации эверолимуса в воздухе рабочей зоны, мг/м³;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями методики измерений.

Результат количественного химического анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/м³;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл. 1).

Если полученный результат измерений ниже нижней (выше верхней) границы диапазона измерений, то производят следующую запись в журнале: "массовая концентрация эверолимуса менее 0,001 мг/м³ (более 0,01 мг/м³)".

Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

Приемлемость результатов измерений, полученных в двух лабораториях, оценивают сравнением разности этих результатов с критической разностью CD_0,95 по формуле:

где C_cp1, C_cp2 - средние значения массовой концентрации эверолимуса, полученные в первой и второй лабораториях, мг/м³;

CD_0,95 - значение критической разности, % (табл. 1).

Если критическая разность не превышена, то приемлемы оба результата измерений, проводимых двумя лабораториями, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если критическая разность превышена, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 (п. 5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-02, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-02.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.

Приведение объема воздуха к стандартным условиям при температуре 293 К (20 °C) и атмосферном давлении 101,33 кПа (760 мм рт. ст.):

V_t - объем воздуха, отобранный для анализа, дм³;

P - барометрическое давление, кПа (101,33 кПа = 760 мм рт. ст.);

t - температура воздуха в месте отбора пробы, °C.

Для удобства расчета V₂₀ следует пользоваться таблицей коэффициентов (прилож. 2). Для приведения воздуха к стандартным условиям надо умножить V_t на соответствующий коэффициент.