"МУК 4.1.2864-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методика измерений остаточных количеств Тиабендазола в семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 N 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 марта 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики от 23.11.2010 N 01.5.04.693.

Настоящие Методические указания устанавливают метод измерения массовой концентрации Тиабендазола в семенах и масле рапса в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Действующее вещество: Тиабендазол.

Структурная формула (не приводится).

Название действующего вещества по ИЮПАК: 2-(1,3-тиазол-4-ил)бензимидазол.

2-(4-тиазолил)-1H-бензимидазол (С.А.).

Область применения: Тиабендазол - системный фунгицид защитного и лечебного действия. Тиабендазол образует защитный слой на обработанной поверхности, используется на овощных, плодовых и зерновых культурах. Не совместим с купратами и окисляющими агентами, такими как хлораты и нитраты.

Гигиенические нормативы для Тиабендазола в семенах и масле рапса в России не установлены.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении Тиабендазола методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем с последующей очисткой на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения Тиабендазола достигается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа.

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками не ниже указанных.

Отбор проб семян рапса производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 2 месяцев.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы проверяют чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 куб. см растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С до объема 1,0 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Spherisorb Phenyl) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 ч.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г 98%-ной ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 мл смешивают 800 мл н-гексана и 200 мл ацетона. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 мл смешивают 150 мл н-гексана и 850 мл ацетона.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску Тиабендазола (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 мл, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 1,0 мг/куб. см).

Для внесения в контрольный образец при определении полноты извлечения используют стандартный раствор, разбавленный ацетонитрилом до нужного уровня концентраций методом последовательного разбавления. Растворы для внесения в масло готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация Тиабендазола в растворе) в хроматограф вводят по 20 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации Тиабендазола в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента:

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 куб. см смеси гексан - ацетон (80:20, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 куб. см элюента N 2 и 30 куб. см элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения Тиабендазола на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 0,1 куб. см стандартного раствора Тиабендазола с концентрацией 10 мкг/куб. см. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 куб. см элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 куб. см элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 50 куб. см элюента N 1, которые отбрасывают, затем 100 куб. см элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 куб. см каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание Тиабендазола (п. 2.6.3).

Фракции, содержащие Тиабендазол, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют (п. 2.6.3). Рассчитывают содержание Тиабендазола в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания Тиабендазола и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.6.1. Извлечение Тиабендазола из проб семян и масла рапса

Навеску измельченных семян массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 100 мл и экстрагируют Тиабендазол 40 куб. см ацетонитрила на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды порциями по 30 куб. см.

Навеску масла массой 20 г помещают в делительную воронку емкостью 250 куб. см и экстрагируют Тиабендазол трижды ацетонитрилом порциями по 30 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая нижний органический слой.

Объединенные экстракты семян или масла промывают гексаном в делительных воронках дважды по 25 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 1 - 2 мин. и собирая нижний органический слой.

После этого экстракты выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстрактов проводят на колонке с силикагелем по п. 2.6.2.

Внимание! Отделение ацетонитрильного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.2. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.1 экстрактов растительных материалов, количественно переносят двумя порциями смеси гексан - ацетон (80:20, по объему) по 5 куб. см каждая в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 50 куб. см элюента N 1, который отбрасывают. Тиабендазол элюируют 80 куб. см элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 куб. см. Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Колонка Spherisorb Phenyl (150 х 4,6) мм, 3 мкм (Waters, USA).

Температура колонки 30 +/- 1 °С.

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Рабочая длина волны 300 нм.

Объем вводимой пробы 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,00 мкг/мл.

2.6.4. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание Тиабендазола в образцах семян или масла (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств Тиабендазола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2 параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор Тиабендазола 2 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где:

Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг) <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения Тиабендазола в рапсе.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

где ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

6.1. При работе необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 1.2.2701-10 и ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Россельхозакадемии, г. Санкт-Петербург.

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 01.5.04.686) и внесена в Федеральный реестр (ФР. 1.31.2011.09107).